微透析应用和进展专家讲座

微透析技术应用进展中医药学院中药新药试验室微透析应用和进展第1页微透析技术基本原理微透析技术发展沿革及优缺点微透析系统组成微透析探针设计及种类微透析技术定量研究微透析技术在生物学中应用

主要内容微透析应用和进展第2页

微透析技术（microdialysis，简称MD）是从神经化学领域发展起来能够对内源性神经递质及其代谢物进行实时取样新技术。微透析应用和进展第3页微透析技术基本原理透析针插入生物组织或生物母体,灌流液由体外微量灌流泵推入膜内套管,透析膜孔径允许小分子自由扩散经过而阻止蛋白质等大分子经过，透过膜小分子物质被透析管内连续流动灌流液不停带出。微透析应用和进展第4页活体微透析技术原理示意图微透析应用和进展第5页微透析应用和进展第6页微透析应用和进展第7页微透析技术发展沿革由早期神经化学试验室中灌流取样技术发展和延伸而来。1961年Gaddum推拉式灌流取样技术1972年Delgado组织透析取样技术1974年Ungestedt深入发展，申请适合用于人和动物专利微透析应用和进展第8页微透析技术发展沿革早期研究多用于大脑神经生物学研究扩展到许多领域：血液、心、肝、肾脏、皮下脂肪组织、眼部组织、肌肉应用到临床微透析应用和进展第9页汉字全文期刊网：年45篇，年37篇微透析应用和进展第10页活体(Invivo)、实时（Intime）、在线（Online）时间分辨性空间分辨性提供游离态小分子化合物,对药品研究有主要意义样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定微透析技术(MD)优缺点微透析应用和进展第11页不足：回收率低,通常在15%左右探针植入会造成局部轻微损伤。回收率测定即使种类繁多,但每种方法都不够完善,影响了实际浓度计算要求探头必须准确插在同一取样部位极难进行以秒为单位动态观察微透析技术(MD)优缺点微透析应用和进展第12页微量灌流泵探针灌流液搜集器分离检测装置微透析系统组成微透析应用和进展第13页A—灌注液(在透析针内);B—灌流泵;C—连接管;D—样品搜集;E—微透析探针微透析系统组成微透析应用和进展第14页微透析探针关键部分是微透析探针：

探针长度普通在0.5-10mm，膜材料惯用纤维素膜、聚丙烯腈膜等组成。

管状半透膜（微透析膜）进液管出液管针柄部分微透析应用和进展第15页微透析探针种类微透析探针

分流式（血液和胆汁）依据材料不一样并联串联同心圆式套管式线性环形柔性（静脉物质）刚性（脑内）（皮肤、肌肉、肿瘤）微透析应用和进展第16页微透析探针种类线性同心圆式柔性分流式微透析应用和进展第17页串联（水平）式探头主要利用“横穿脑”技术植入脑或组织内。透析管除了透析部分外，表面用一个不通透如环氧树脂封闭。此法优点在于简便易行，探头一旦植入即可随动物移动。其缺点在于植入过程中要在出入口各打一洞，引发所经过脑区，颅骨及肌肉产生过多损伤。微透析应用和进展第18页并联（垂直）式探头经过立体定向仪能准确定位到所需测定区域。同心圆式探头当前最流行，这种探头采取管内套管设计，能够制作直径小，适合于经过预先埋置引导管插入组织，为慢性试验提供方便。微透析应用和进展第19页灌流液进行微透析试验时，使用灌流液中各离子组份浓度应与脑内（组织）细胞外液保持一致。以脑微透析为例：Ca2+浓度对试验结果成败极为关键，当前认为细胞外Ca2+浓度预计值1.2mM。试验室惯用灌流液浓度为，NaCL140mM、KCl2.4mM、MgCL21.0mM、CaCL21.2mM、NaHCO35.0mM、Ascorbicacid0.6mM（pH7.4）。微透析应用和进展第20页样品搜集微透析试验使用灌流速度普通不超出5－10μl/min。高流速并不能深入增加物质跨膜流量（绝对回收率），而且灌流液在压力下流出探头可能会引发组织损伤。灌流开始时，回收率较高，普通认为，这是探头插入所引发伤害性组织反应。普通经过30－60min后，回收率基本趋于稳定。微透析应用和进展第21页样品检测透析样品可直接用HPLC/电化学/荧光/紫外/质谱等检测技术或其它高灵敏度微量化学分析法测定。对于一些含量极低物质，可增加回收率方法来填补灵敏度不足。如可加长透析膜有效长度、改变灌流速度，也可使用药品方法（如在灌流液中添加摄取阻断剂）以提升待测物质含量。微透析应用和进展第22页样品检测依据分离检测伎俩不一样，微透析试验又能够分为基于非分离和基于分离微透析方法。微透析应用和进展第23页基于非分离微透析方法(non一separationbasedapproaches)基于非分离方法主要有生物传感器法、免疫法和质谱法。

生物传感器主要部分是酶电极，能够特异地与透析液中待测物反应，并被检测器检测。微透析应用和进展第24页基于分离微透析方法(separationbasedapproaches)：主要有高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)。微透析样品属于亲水性物质离子性溶液

与非分离微透析方法相比，基于分离微透析方法普通能够同时测定多个化合物。普通来说，依据检测物质不一样，紫外、荧光、电化学检测和质谱法是HPLC惯用检测方法。而CE惯用电化学检测器和激光诱导荧光法检测。微透析应用和进展第25页微透析取样和多级质谱装置流程图微透析应用和进展第26页在线微透析液相色谱电喷雾质谱偶联装置示意图微透析应用和进展第27页毛细管电泳-多级质谱与微透析采样联用示意图微透析应用和进展第28页等电电点聚焦-微透析-质谱联用微透析应用和进展第29页高效液相离子色谱在线微透析质谱联用示意图微透析应用和进展第30页微透析回收率：探针回收率是指灌流液中流出待测组分与标准浓度之比(Ces/Cos)百分数。

微透析技术用于定量分析首先应该处理问题就是怎样对取出样品进行准确可靠校正。而探针回收率是计算待测物浓度前提条件。微透析技术定量研究微透析应用和进展第31页探针回收率是影响微透析结果正确性主要原因,其值取决于：取样部位生物特征透析膜物理及化学性质(材料、孔径、长度及几何形状等)待测物分子质量在生物介质中扩散速度和灌流速度、压力、温度等。微透析应用和进展第32页微透析回收率测定方法：

1体外校正(体外回收率)

当不需测定样品绝对含量,只需计算被测药品相对浓度改变时,可采取体外回收率测定方法。测定宜在取样前后马上进行,将探针放入已知浓度标准溶液中,用与体内试验相同流速灌流探针,到达稳定状态后搜集灌流液并进行测定。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。试验前后回收率误差小于5%微透析应用和进展第33页2体内校正需测定样品绝对含量

内标法

零净流量法

低灌注流速法微透析应用和进展第34页内标法:

将已知浓度内标加至灌流液中，假设透析液中待测物与内标回收率一致，经过内标法定量求得待测物绝对量。灌流液中内标物已知浓度(Cic)，透析液中内标物浓度(Cec)，体内回收率(Rin，viv)可用下式计算:Rin，viv=(1-Cec/Cic)×100%微透析应用和进展第35页①内标必须与待测物化学结构相近②二者在血液及组织中扩散及消除速度一致③内标不影响所研究药品在组织中药理活性微透析应用和进展第36页零净流量法:

当透析液中被分析物浓度与体内浓度一致时，没有物质交换，到达稳态,在该状态下，可将一系列已知浓度待测物加至灌流液中以测定透析液中待测物浓度。以透析液中待测物浓度为纵坐标，已知浓度待测物浓度为横坐标，作直线，其斜率即为回收率。微透析应用和进展第37页优缺点：方法比较准确，但费时，准确性有赖于灌流液中待测物浓度准确性及已知浓度点数目。微透析应用和进展第38页低灌注流速法：

在低流速(小于0.05μl/min)条件下,对活体组织进行灌流,即为低灌注流速法。此时,分子质量小于500化合物回收率可达95%以上。在极慢灌流速度下,回收率可达100%,所引入误差可忽略微透析应用和进展第39页影响微透析回收率原因：温度灌注速度透析膜物理及化学性质探针形状被分析对象性质被分析对象在生物介质中扩散速度。微透析应用和进展第40页应用微透析技术检测相关物质能量代谢物主要包含葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐、腺苷、黄嘌呤等氨基酸类神经递质兴奋性氨基酸(EAA)包含谷氨酸和天冬氨酸在脑细胞缺血损伤中作用已得到广泛认同自由基相关物质如尿囊素、尿酸等组织损坏标志物如甘油等各种药品微透析应用和进展第41页乳酸/丙酮酸比（lactate/pyruvateratio,LPR）

反应由缺血等引发细胞氧化还原状态改变显著标志。组织缺血时，氧供降低，糖酵解增加，丙酮酸向乳酸转化增加，LPR随之升高；伴随糖含量降低，丙酮酸生成降低，LPR深入增高，缺血恶化。微透析应用和进展第42页丙三醇

丙三醇是胞膜一个组分。缺血时，能量衰竭可造成胞膜分解，丙三醇释放入组织间液。丙三醇是组织低氧与细胞破坏有效监测指标，增高可提醒缺血脑组织开始恶化。严重或完全缺血时，丙三醇能够升高4～8倍。微透析应用和进展第43页谷氨酸

兴奋毒性是继发性脑损伤一个机制，它经过谷氨酸介导离子通道开放，引发细胞大量钙离子内流而造成细胞损伤。脑透析液中谷氨酸增加是细胞损伤直接标志微透析应用和进展第44页葡萄糖

①缺血：缺血时毛细血管血流降低，转入透析导管中糖降低。②充血：毛细血管血流增加，转入导管中糖增加。③高血糖：血糖增高，透析液中糖浓度也增高④高代谢或低代谢：代谢高低可增加或降低糖摄取，影响组织中糖含量，造成分析液中糖浓度增加或降低微透析应用和进展第45页药品采取体内微透析-毛细管电泳/电化学检测法(CEEC)测尼古丁；Hogan采取微透析-毛细管电泳/激光诱导荧光,用于监测一个抗肿瘤药品在血液中药代动力学微透析应用和进展第46页微透析技术在生物学中应用神经药理学研究领域临床诊治中医药研究领域微透析应用和进展第47页神经药理学研究领域药效学研究经过分析透析液中内生神经递质、神经调质,可直接衡量药品治疗效果,有利于探讨药品作用机理。

Hargreaves利用微透析技术监测了接收手术去除受损磨牙患者,发觉预先服用甲基泼尼松龙可使缓激肽释放降低。微透析应用和进展第48页神经药理学研究领域药品代谢研究微透析技术比传统技术愈加清楚、全方面地反应了药品在体内中间代谢过程。

Scott等应用微透析技术,经过监测扑热息痛和它葡糖苷酸浓度-时间改变来研究其药动学和药代学微透析应用和进展第49页神经药理学研究领域药动学研究早期微透析药动学研究主要是在中枢神经系统,最近也有用于其它各种不一样组织研究报道,而说明中枢药品作用机制对于研究药品与血脑屏障关系很有意义。

Tsai等从血液、海马区和胆汁3个方面同时使用微透析探针进行了黄芩素药品动力学研究。微透析应用和进展第50页临床诊治临床当前主要包括颅脑损伤、蛛网膜下腔出血、癫痫、帕金森氏病、脑肿瘤等领域。

国外微透析技术和设备已逐步标准化,被作为一个常规方法用于神经外科手术和神经病变监护治疗,并能提供正常参考值来评价患者透析期间改变,大大降低患者死亡率。有研究显示,微透析能在患者脑缺血局部脑氧分压和脑血流量出现改变后5～30min即发当代谢物浓度改变,早于临床症状,为临床治疗提供更大空间。微透析应用和进展第51页临床诊治用来选择具穿透力抗肿瘤化疗药品作为抗微生物药品“组织穿透力”判定方法。微透析应用和进展第52页中医药研究领域在脑变性研究方面应用

陈氏等应用微透析发觉黄芪皂苷不能降低缺血/再灌时谷氨酸释放。有学者应用脑内微透析技术观察发觉,丹参经过降低半胱氨酸、谷胱甘肽、兴奋性氨基酸及NO代谢产物水平发挥脑保护作用。微透析应用和进展第53页中医药研究领域在针灸治疗方面应用人体经络是一个完整、动态系统,只有在线研究能考查针刺部位所产生一系列生理改变。微透析在线、多靶点监测特点全方面反应了考查针刺反应起效部位、微环境改变,有可能成为诠释经络、腧穴功效有力工具。

郭氏等采取微透析技术研究发觉,电针可抑制细胞外兴奋性氨基酸过量堆积。微透析应用和进展第54页经穴处Ca2＋浓度高于非经穴处。经络穴位处存在Ca、P、K、Fe、Zn、Mn等元素富集现象，Ca元素浓度与P、K、Fe、Zn、Mn等元素有正相关性。结合经络功效和针灸临床，借助当代科技伎俩，如