抗体技术医学宣教专家讲座

抗体分子抗体技术医学宣教专家讲座第1页AntibodyIgGstructure抗体技术医学宣教专家讲座第2页AntibodyIgGstructure抗体技术医学宣教专家讲座第3页CLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3AntibodyIgGstructure抗体技术医学宣教专家讲座第4页VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcMembraneExtensionAntibodyIgGstructure抗原结合片段恒定区片段抗体技术医学宣教专家讲座第5页VHVLCLCH1CH2CH3AntibodyIgGstructure抗体可变区片段抗体技术医学宣教专家讲座第6页VHVLCLCH1CH2CH3Fv抗体技术医学宣教专家讲座第7页FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable抗体技术医学宣教专家讲座第8页抗体——生物体最奇妙分子●无限多样性（diversity)●功效与结构双重性

可变区——抗原结合恒定区——生物学效应功效●分泌型和膜型表示抗体技术医学宣教专家讲座第9页与抗体相关诺贝尔奖取得者1901vonBering血清治疗1908Ehrlich&Metchnikoff抗体生成、吞噬1972Edelman&Poter抗体分子结构1977Yalow放射免疫测定1984Koler,Milstein&Jerne单克隆抗体1987TonegawaIg基因结构抗体技术医学宣教专家讲座第10页本节课主要内容一、细胞工程抗体和基因工程抗体二、治疗性单抗研制进展抗体技术医学宣教专家讲座第11页一、细胞工程抗体和基因工程抗体抗体研究领域进展大致可分为三阶段：以1890年Behring发觉白喉毒素免疫血清（白喉抗毒素）为代表，其特点是用抗原免疫动物来取得多克隆抗体;以1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表;以1994年Winter用基因工程方法制备抗体为代表;抗体技术医学宣教专家讲座第12页（一）多克隆抗体

(Polyclonalantibody)1.概念给动物接种抗原所取得免疫血清或抗血清是各种抗体混合物,它是由各种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生,称为多克隆抗体.抗体技术医学宣教专家讲座第13页

2.多克隆抗体应用免疫学检测被动免疫治疗和紧急预防3.存在问题

特异性差,用于免疫学检测轻易出现交叉反应

抗体技术医学宣教专家讲座第14页（二）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)

经过B细胞杂交瘤技术,取得特异性针对某一个抗原决定簇细胞克隆，产生均一性抗体.

抗体技术医学宣教专家讲座第15页单克隆抗体特征

高度均一性：

纯度很高均一性抗体

高度专一性：

只反抗原分子上某一抗原决定簇起反应

大量产生及稳定性：

杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代

抗体技术医学宣教专家讲座第16页１、细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体抗体技术医学宣教专家讲座第17页抗体技术医学宣教专家讲座第18页抗体技术医学宣教专家讲座第19页抗体技术医学宣教专家讲座第20页杂交瘤技术制备单克隆抗体主要步骤包含

（1）抗原制备；

（2）免疫动物；

（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞制备；

（4）细胞融合；

（5）杂交瘤细胞选择培养；

（6）杂交瘤细胞筛选；

（7）杂交瘤细胞克隆化；

（8）单克隆抗体检定；

（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系建立；

（10）单克隆抗体大量制备。抗体技术医学宣教专家讲座第21页免疫动物免疫动物是用目标抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞过程。普通选取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，抗原经过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激对应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞抗体技术医学宣教专家讲座第22页细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养细胞融合基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞混合，在PEG作用下融合，然后用培养液将PEG融合液迟缓稀释,将混合体系移入选择性培养基HAT中培养。抗体技术医学宣教专家讲座第23页HAT选择性培养原理融合后产生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞和未融合骨髓瘤细胞。次黄嘌呤（H）、氨基碟呤（A）和胸腺嘧啶（T）氨基碟呤（A）阻断嘌呤和嘧啶合成抗体技术医学宣教专家讲座第24页HAT选择性培养原理骨髓瘤细胞选取次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺点型,不能利用外源性次黄嘌呤来合成本身核酸中所需要嘌呤，而内源性嘌呤和嘧啶合成又被氨基碟呤所阻断，不能在HAT培养基上生长。B淋巴细胞无法在体外繁殖传代。脾细胞内有这种转移酶，故脾瘤杂交细胞能用H和T合成DNA而得以生长。抗体技术医学宣教专家讲座第25页在最适培养条件下，大约105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，单个或少数杂交瘤细胞多半不易存活，通常加入喂养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞）喂养细胞释放一些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能去除死亡细胞，应用较多。抗体技术医学宣教专家讲座第26页筛选阳性克隆与克隆化抗体产生细胞只占全部脾细胞5%左右，所以融合后8-9天对每孔培养上清液进行抗体活性筛选工作，筛选出产生抗体阳性克隆。惯用方法：酶联免疫吸附法，免疫荧光技术（适合用于细胞抗原抗体检测）和放射免疫技术。尽早克隆化。抗体技术医学宣教专家讲座第27页杂交瘤细胞与抗体性状判定对杂交瘤细胞进行染色体分析对杂交瘤细胞产生单克隆抗体进行Ig类和亚类判定对单克隆抗体特异性、纯度和识别抗原相对分子质量进行测定。抗体技术医学宣教专家讲座第28页单克隆抗体大量制备体外培养法在培养液中添加10%-20%小牛血清，因为培养液中含有血清成份，总蛋白量可达100mg/ml,纯化困难。小牛血清又是支原体污染原因。无血清培养法：利用白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。但产量不高。用悬浮培养方式代替静止培养法，微载体悬浮培养抗体技术医学宣教专家讲座第29页多采取动物体内诱生法杂交瘤细胞两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，故选取BALB/c小鼠制备单克隆抗体。先给小鼠注射刺激性有机溶剂降植烷（破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖环境），然后注射杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。操作简便，经济，所得单克隆抗体量多且效价高，可有效保留杂交瘤细胞株。缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠各种杂蛋白，给纯化带来难度。抗体技术医学宣教专家讲座第30页单克隆抗体纯化在纯化之前必须明确其Ig类和亚类，Ig类和亚类不一样，纯化方法也不一样；依据用途不一样选择不一样纯化方法；如用于体外诊疗试剂IgG类抗体应采取沉淀处理结合亲和层析亲和层析方法。IgM类抗体应采取沉淀处理结合凝胶过滤方法；体内诊疗试剂或治疗用药品应去除内毒素、病毒、核酸等微量污染物，必须采取亲和层析和阴离子交换层析。抗体技术医学宣教专家讲座第31页动物体内诱生法制备单克隆抗体纯化方法：1澄清和沉淀处理2分离凝胶过滤阴离子交换层析亲和层析抗体技术医学宣教专家讲座第32页２、单克隆抗体在医学上应用A、用作诊疗试剂

1.检测淋巴细胞表面分子，区分不一样分化阶段淋巴细胞，判别淋巴细胞。

2.判定病原体，准确诊疗传染病。

3.用于肿瘤诊疗和分型

4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌功效状态

抗体技术医学宣教专家讲座第33页B、用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子功效C、用于疾病治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应防治抗细胞因子单抗用于本身免疫性疾病治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤导向治疗抗体技术医学宣教专家讲座第34页单克隆抗体用于免疫治疗存在问题单克隆抗体特异性因为肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性单抗，对正常组织有交叉反应2）异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，造成异源性超敏反应抗体技术医学宣教专家讲座第35页（三）基因工程抗体

(Geneticengineeringantibody)

依据研究者意图，采取基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表示，产生新型抗体。主要包含嵌合抗体、小分子抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。抗体技术医学宣教专家讲座第36页小分子抗体鼠单抗人源化基因工程改造抗体抗体技术医学宣教专家讲座第37页小分子抗体抗体技术医学宣教专家讲座第38页小分子抗体基因工程小分子抗体仅表示鼠源性McAbV区（CDR）片段，其相对分子质量仅为原抗体1/80-1/3。Fab片段抗体，由完整轻链和重链(VH+CH1）组成

Fv抗体（VH+VL，非共价结合）单链抗体:由VH和VL经过一段连接肽（Linker）连接而成重组蛋白单域抗体：由VH或VL单个可变区抗体技术医学宣教专家讲座第39页抗体融合蛋白抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体抗体技术医学宣教专家讲座第40页抗体融合蛋白酶-抗体型偶合蛋白（抗体酶）在药品治疗中应用前景辽阔，它可在靶向位置上将前体药品转化成有效药品。当抗体和酶融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药品，药品经酶催化显示活性，提升肿瘤区域药品浓度，降低对正常细胞毒性。构建抗体融合蛋白基本标准：将第一个蛋白终止密码子删除，再接上带有终止密码子第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表示。抗体技术医学宣教专家讲座第41页在构建过程中关键问题是两个蛋白间Linker序列，普通3-5个氨基酸可满足大部分融合蛋白正确折叠要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性肽链，可缓解两种蛋白相互干扰。在真核细胞中表示普通不包括复性问题，其优点是能够将抗体多肽正确折叠和糖基化，省去了繁杂体外复性，缺点是产量低。在原核细胞中表示有两种形式：一个分泌至菌体外，成为有活性可溶性融合蛋白；另一个以胞内包涵体形式存在，需溶解包涵体重新折叠，成为有活性蛋白质。抗体技术医学宣教专家讲座第42页嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出功效性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表示载体，转染宿主细胞，表示人-鼠嵌合抗体。特点：降低了鼠源性抗体免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原能力。保留鼠源性McAbCDR区结构，抗体活性不会消失（CDR区以外其它部分不影响抗体活性），将C区用人Ig分子C区置换，则对人免疫原性消失。抗体技术医学宣教专家讲座第43页嵌合抗体嵌合抗体是构建第一个基因工程抗体，构建时可反抗体亚类进行变换，增强抗体免疫治疗效果。其半衰期约为鼠源6倍，介导细胞毒性所需抗体浓度也低于原McAb。20世纪末期构建了为数众多抗各种恶性肿瘤嵌合抗体，但真正应用于临床较少，主要是因为该技术已被日益成熟人源化抗体技术所取代。抗体技术医学宣教专家讲座第44页人源化抗体（humanizedantibody)利用基因工程方法将鼠McAb除重链、轻链互补决定区（CDR）以外基因全部置换成人抗体基因。又称CDR移植抗体最大程度地降低了鼠McAb免疫原性,在人体内生物半衰期基本上与人抗体类似。至今已经有近百种人源化抗体申请临床试验，正在进行临床试验有30各种，有些已完成Ⅲ期临床试验并获政府同意上市销售。抗体技术医学宣教专家讲座第45页鼠单抗人源化●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体●用抗体库技术进行人源化抗体技术医学宣教专家讲座第46页鼠单抗人源化抗体技术医学宣教专家讲座第47页双价抗体与双特异性抗体(bispecificantibody)

许多抗原抗体反应要求双价抗原结合位点，使抗原分子上两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子抗体连结在一起，可使效应细胞更轻易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞作用。抗体技术医学宣教专家讲座第48页构建方法化学交联法用化学试剂随机交联两个Ig分子表面上巯基，构建双功效抗体。化学交联可能破坏抗体功效，不易抵达靶向部位，体内稳定性差，每次应用都须重新构建抗体技术医学宣教专家讲座第49页生物学方法将分泌目标单克隆抗体杂交瘤细胞与分泌另一个抗体脾细胞融合，形成可分泌亲代抗体和杂种抗体杂种-杂交瘤细胞。构建过程复杂，周期长，产量低，纯化技术复杂，基因组过大不稳定。抗体技术医学宣教专家讲座第50页基因工程方法1993年Holligen等构建出小分子双功效抗体（SCFV）2，是双功效抗体研究领域里程碑。用接头连接不一样抗体VH和VL区，使它们不能形成链内分子配对，让其形成原抗体分子内配对构建成双特异性（SCFV）2。双功效抗体一臂识别肿瘤细胞抗原（癌基因产物），另一臂识别免疫效应细胞及分子，介导T淋巴细胞或毒素与药品发挥细胞毒作用抗体技术医学宣教专家讲座第51页单链抗体单链抗体很好地保持了抗体亲和力，相对分子质量小、穿透力强、免疫原性小，且易与效应效应分子相连接，构建出各种新功效抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体理想元件。所以成为基因工程抗体研究领域热点。单链抗体基因构建普通方法：采取从杂交瘤细胞提取mRNA,反转录成cDNA，经过PCR扩增抗体VH和VL基因，人工合成一条寡核苷酸序列（Linker序列），将VL与VH连接构建单链抗体基因抗体技术医学宣教专家讲座第52页修饰抗体（modifiedantibody)将放射性核素、生物毒素（白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、蛇毒蛋白、相思子蛋白）或毒性极强合成药品及抗生素等共价结合到抗体分子上.经过McAb可特异地将毒素导向肿瘤细胞等靶部位，以到达毒杀肿瘤细胞而少损伤正常细胞功效，形象地称之为生物导弹（药品导弹、免疫毒素）。抗体技术医学宣教专家讲座第53页治疗性单抗研究进展抗体技术医学宣教专家讲座第54页1.杂交瘤-单克隆抗体技术诞生2.抗独特型治疗淋巴瘤成功3.OKT3被同意上市

4.单抗用于肿瘤治疗效果不佳5.抗内毒素单抗试用于败血性休克失败6.抗17-1A和ReoPro上市7.FDA同意6个单抗上市治疗性抗体发展历程和事件抗体技术医学宣教专家讲座第55页OKT3OKT3是美国Ortho企业生产OKT(OrthoKungTcellOKT)系列中一个抗人T淋巴细胞分化抗原CD3单克隆抗体，CD3抗原是成熟T细胞共同分化抗原，在全部外周血T细胞和胸腺、淋巴结内靠近成熟T细胞上表示。OKT3作为一个免疫抑制剂，主要用于预防和治疗同种异体肾移植等器官移植后急性排斥反应。OKT3主要经过细胞去除、不育性激活、功效性受体封阻、免疫调变、刺激抑制细胞增殖以及直接作用于效应细胞等路径杀伤成熟T细胞或阻断机体细胞免疫反应到达抗排斥目标。抗体技术医学宣教专家讲座第56页抗17-1A：主要作用于结肠癌、直肠癌病人原发和转移肿瘤；Reopro是一类抗体类药品，1994年首度取得同意，用于冠状动脉手术及心脏搭桥患者治疗，以预防其血液拴塞。抗体技术医学宣教专家讲座第57页抗体名称

抗体种类

靶向抗原

适应症 同意日期

OKT3

鼠单抗

CD3

移植排斥

1986 Panorex

鼠单抗

17-1A

大肠癌

1995（德国） ReoPro

人-鼠嵌合Fab

血小板受体

冠心病

1994

ⅡbⅢa

Rituxan

人-鼠嵌合抗体

CD20

淋巴瘤

1997 Simulect

人-鼠嵌合抗体

CD25

移植排斥

1998 Remicade

人-鼠嵌合抗体

TNF-α

炎症性肠病、

1998、

类风湿关节炎

1999Zanapax

人源化抗体

CD25

移植排斥

1997 Herceptin

人源化抗体

HER-2

乳腺癌

1998 Synagis

人源化抗体

RSVF蛋白

RSV感染

1998 Mylotarg

人源化抗体-

CD33

淋巴瘤

化疗药品交连物Campath

人源化抗体

CD52

淋巴瘤

已同意上市治疗性单抗抗体技术医学宣教专家讲座第58页治疗性单抗销售概况抗体技术医学宣教专家讲座第59页国外相关抗体开发评述正在临床试用治疗性单抗超出上百种1998-年20%研制生物药品为单抗10年后市场上单抗将从现在11个→100个以上，预计销售额为$500亿预计到年7个主要市场用于肿瘤治疗性单抗销售额达44亿美元抗体技术医学宣教专家讲座第60页进入临床治疗性单抗情况分析治疗肿瘤：32%治疗免疫系统相关疾病：37%器官移植：11%感染：8%心血管：4%其它：6%●所治疗疾病抗体技术医学宣教专家讲座第61页●所针正确抗原

/抗原数/应用数细胞膜分子：▲CD系列：35%