神经细胞体外培养方法及应用

神经细胞体外培养方法及应用第1页/共30页神经细胞体外培养的历史神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explantculture）发展到分离细胞培养(dissociatedcellculture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。第2页/共30页

组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养第3页/共30页神经组织的植块培养法悬滴培养方法单盖玻方法双盖玻方法1925改良双盖玻方法培养物：CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段↓↓突起非神经元外伸第4页/共30页优点

所需培养液量少，可反应组织代谢中微量生化改变保留了植块内组织特征第5页/共30页不足

培养空间小，O2CO2供少培养空间湿度难以控制，水分会蒸发密封手续繁杂，不利更换培养液，难以观察单个神经元生长。第6页/共30页神经元的分离细胞培养方法1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织神经元增殖发生于胚胎期形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大第7页/共30页神经元的体外培养液

天然合成成分血清血浆胚胎撮液人工培养基无血清培养基化学限定性培养基常用的：DMEM+添加剂

F12第8页/共30页①葡萄糖为神经元能量代谢主要来源33mm②CO2NaHCO3缓冲系统重要HEPESO2耗量更高③K+

神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+24.5mM能提高神经元存活，促分化④非神经元成分的抑制有2-3天第9页/共30页神经元无血清限定培养液

人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。第10页/共30页选择添加剂的基本过程

限定连续细胞系的体外生长条件。试定该细胞系来源的细胞的培养液条件。第11页/共30页Bottenstein实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好

人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F12与DMEM1:1混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为N1、N2、N3。第12页/共30页N1的配方为胰岛素5μg/ml转铁蛋白5μg/ml孕酮20nM腐胺100Um硒30nM第13页/共30页神经体外培养的生长基质

胶元多聚赖氨酸

LN第14页/共30页神经细胞培养操作程序表

脊髓后根节大脑皮质孕18~20天大鼠胚胎新生1~3天大鼠

在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜

与CMF-Hanks液一起移至离心管舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液第15页/共30页370C，30min舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200r/min，8min第16页/共30页加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1×107种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50μl放入CO2孵箱中过夜次日加3ml培养液2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液第17页/共30页神经元的分离培养过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源新生大鼠1-2日龄，碘酒，洒精消毒。断头，取出大脑，分离脑膜，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍。剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去残血加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴箱中消化20-25分钟。终止消化离心洗涤2000转/分，5分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。370C5%CO2培养2天后换生长培养液第18页/共30页大鼠海马神经细胞培养方法

神经元体外生长特征接种密度与体外存活率

当96孔每孔2000-3000个或7000-10000个/cm2几乎无神经元存活

当8000-12000个/96孔或2.8万-4万个/cm2

存活率最大。3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前3天加药最好第19页/共30页神经元的体外存活时间

短1-2W

长4个月第20页/共30页体外分化标志破伤风毒素

NSENF200,NF160第21页/共30页神经细胞的特殊染色鉴定方法

尼氏体染色

焦油紫

甲苯胺蓝硫瑾等组化染色镀银染色

NADPH-d特异性神经组织化学法第22页/共30页神经细胞培养的应用应用领域研究各种因素对神经的影响1.化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。2.药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子（bFGF），神经营养因子3.细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。4.各种生理病理状态下神经元状态改变第23页/共30页实验方法研究手段及测量指标1.形态学观察：光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触电镜：超微结构。2.激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope,LCSM)：研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建3.膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。第24页/共30页研究手段及测量指标4.聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化5.染色：苏木素-伊红（HE）染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。6.显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。7.荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的OD值第25页/共30页培养神经细胞的观察和鉴定1.神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。2.特殊培养阶段：培养的9到12天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。3.形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，