乳酸脱氢酶活力测定(精)课件

乳酸脱氢酶活力测定目的要求（1）学习LDH活力测定原理；（2）测定动物肌肉组织提取液LDH活力及比活力。原理乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，简称LDH）广泛存在于动物、植物及微生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化如下反应：LDH乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上清为组织提取液。LDH测定方法很多，紫外分光光度法最为简便快速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶的含量。本实验反应液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义为：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位，定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。试剂与器材材料：动物的肌肉、肝、心、肾等组织。匀浆缓冲液：10mmol/LpH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。酶活力测定试剂：（1）0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液(PB)100ml；（2）NADH溶液：3.5mg纯NADH以0.1mol/LpH7.5PB1ml稀释。（3）丙酮酸溶液：2.5mg丙酮酸钠，以以0.1mol/LpH7.5PB29ml稀释。试剂（2）（3）最好在临用前配制。操作方法（一）制备肌肉匀浆（二）LDH活力测定（三）蛋白质含量测定（四）数据处理（一）制备肌肉匀浆取瘦猪肉（或兔肉）一块除去脂肪及筋膜等，称取20g，按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10mmol/LpH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒至烧杯中，置4℃冰箱提取过夜，过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。（二）LDH活力测定实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿，在一只比色皿中加入0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分光光度计中，于340nm处调A值为0；另一只比色皿用于测定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1mlNADH溶液，加盖摇匀后测定A340nm，然后加入经稀释（20倍）的酶液10μl，立即计时，每隔0.5min测A340nm，连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性部分，计算ΔA340nm/min减少值。（三）蛋白质含量测定将组织提取液稀释适当倍数（约1：20），取0.1ml按Folin-酚法测定蛋白质含量。（四）数据处理每毫升组织提取液中LDH活力单位：LDH比活力总LDH活力（U）比活力（U/mg）=————————————总蛋白含量（mg）

ΔA340nm/min×稀释倍数LDH活力单位（U）/ml提取液=————————————————

酶液加入量（10μl）×10-3提取液中LDH总活力单位=LDH活力（U）/ml×总体积注意事项1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在-20℃低温冰箱中。2、酶液的稀释度及加入量应控制A340/nm下降在0.1-0.2之间，以减少实验误差，加入酶液后应立即计时，准确记录每隔0.5minA340下降值。3、NADH溶液应在临