目的基因与克隆载体的体外重组新

目的基因与克隆载体的体外重组新第1页/共22页第五章目的基因与载体的体外重组第2页/共22页基因工程的操作过程切接转增检第3页/共22页连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰第4页/共22页粘性末端连接平末端连接末端延伸连接：连接方式同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物第5页/共22页粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

5'

GAATTCCTTAAG5'

EcoRI第6页/共22页粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclITGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT第7页/共22页粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5'GCCTGAAATTCG5'

退火GCCTGAAATTCG5'

GCTTAA

5'

GACTTAT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GGACTTCCTGAA5'

GCTTAA

5'5'

GACTTA5'

5'

GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamⅢBamⅢ第8页/共22页平末端连接HpaI5'

5'GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5'GTTCAAAACTTG5'

5'

CCCGGG5'

GGGCCC3'

T4-DNAligaseCCCAACGGGTTG5'

5'GTTGGGCAACCC5'

CCCGGGGGGCCC5'

StuI3'

第9页/共22页平末端连接--不同粘性末端的平端连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC第10页/共22页粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5'

5'PstICTGCAGGACGTCPstIlinker第11页/共22页末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP随机加于DNA分子的3‘-OH端5‘p3‘HOOH3‘p5‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p3‘HOp5‘同聚物尾巴Poly（dA）末端延伸连接—同聚物加尾第12页/共22页C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接—同聚物加尾（平齐末端）第13页/共22页末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI第14页/共22页末端延伸连接—同聚物加尾（5‘突出末端）5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI第15页/共22页人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面带有一至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后产生粘性末端末端延伸连接—人工接头加尾CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCC5'

EcoRI第16页/共22页末端延伸连接—人工接头加尾5'5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'T4-DNAligase5'CCGAATTCGG5'

GGCTTAAGCCEcoRICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火EcoRIEcoRIEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCC第17页/共22页DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘性末端（与载体粘端连接）末端延伸连接—DNA衔接物加尾CCG5'

GGCTTAA5'

EcoRIAATTCGG5'

GCC5'

EcoRI第18页/共22页重组率重组率的定义：

重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数

（在常规实验条件下，重组率一般为25-75%）

重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。第19页/共22页重组率提高重组率的方法：提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1~10:1

载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶5'

GAATTCCTTAAG5'

第20页/共22页重组率提高重组率的方法：人工构建粘性末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'CCCCCC