双酶切及连接

双酶切及连接第1页，共20页，2023年，2月20日，星期五目录原理类型命名法实验注意事项连接常见问题及对策第2页，共20页，2023年，2月20日，星期五DNA的限制性酶切实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。第3页，共20页，2023年，2月20日，星期五根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。限制性内切酶的类型第4页，共20页，2023年，2月20日，星期五限制性内切酶的类型

第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第5页，共20页，2023年，2月20日，星期五

第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。限制性内切酶的类型第6页，共20页，2023年，2月20日，星期五第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.

它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。

限制性内切酶的类型第7页，共20页，2023年，2月20日，星期五粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：

5’……G|AATTC……3’3’……CTTAA|G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成

5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。第8页，共20页，2023年，2月20日，星期五II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT|ATC……3’3’……CTA|TAG……5’

切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：第9页，共20页，2023年，2月20日，星期五用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli

用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。

限制性核酸内切酶的命名法第10页，共20页，2023年，2月20日，星期五实验材料及仪器高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，质粒DNA

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双酶切无菌水0.8μL10x缓冲液2μL质粒16μLBglI0.6μLSalII0.6μL共20μL按如下体系加入到0.5ml离心管中加体系离心37℃水浴1h跑电泳第12页，共20页，2023年，2月20日，星期五结果第13页，共20页，2023年，2月20日，星期五结果与分析

质粒的双酶切没有出现结果但marker出了条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物出现了较好的实验结果。第14页，共20页，2023年，2月20日，星期五１．内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定。同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。五、注意事项——限制性内切酶酶切第15页，共20页，2023年，2月20日，星期五连接反应DNA分子的体外连接（重组）是指外源DNA片段和载体DNA分子在体外通过DNA连接酶共价连接。DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由联接酶催化形成磷酸二酯键，即能完成联接反应。第16页，共20页，2023年，2月20日，星期五连接体系10×Buffer2.5μL载体1μLDNA10μLT4酶1μL无菌水10.5μL共25μL第17页，共20页，2023年，2月20日，星期五内切酶失活DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子条件不适（试剂、温度）DNA酶切位点上的碱基被甲基化DNA酶切位点上没有甲基化（如DpnI）DNA位点上存在其它修饰DNA不存在该酶识别顺序标准底物检测酶活性将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA检查反应系统是否最佳换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证六、限制性内切酶酶切常见问题分析问题一：DNA完全没有被内切酶切割原因对策第18页，共20页，2023年，2月20日，星期五内切酶活性下降内切酶稀释不正确DNA不纯，反应条件不佳内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分DNA溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大，取样不准酶切后DNA粘末端退火由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序用5-10倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释，增大取样体积电泳前将样品置65℃保温5-10