案例二第一组课件

问题作为疾控中心检验人员，应该如何应对此次爆发列出案例二中与检验人员有关的案例要点：①患者共同暴露史的婚宴举行于11月9日②目前为止的7名患者出现症状时间为11月9-11日③检验人员到达现场时间为11月13日

④该县已经采集了7例患者的粪便标本送往实验室检测以明确诊断。一.初步分组，制定采样方案

检验科应分为两组：一组应尽快检验已送检的七份新鲜病人的粪便样本，以确保样品的检验质量和代表性，以防前去现场采样的检验组由于各种客观原因（如：病人已服用抗生素）而未采集到新鲜的代表性样品或途中样品不慎损失污染。注意：以上①②③④中提到的样品由于时间问题或服用抗生素原因，代表性较小，仅作参考，若检测结果为与患者症状有关的致病菌阳性才具有重要参考性，但若为阴性，不能排除与患者疾病的爆发有关。⑤中的两份血清样品的检验结果结合之前送检的新鲜样品的检验结果为确证实验二.样本采集水样便或呕吐物取1-3mL；成形便取指甲大小；肛拭子进行肛拭；水样500mL；涂抹标本以3-5支无菌棉拭子涂抹后为一件；食品：液体：250mL；固体：25-50克三.所采样品的送检样品采集后应立即送检。若不能立即送检，应保存于PH8.8-9.0的碱性蛋白胨水中尽快送检。标本与保存液比例约为1：5。24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。四.检验程序②动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。③动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告：高度可疑。2.水样、液体食品样品：取450mL样品，用1mol/L氢氧化钠调整至pH8.8-9.0。然后加10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾0.25mL和1000单位/mL青霉素1mL。37℃培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同粪便等样品。培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物0.2-0.3mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方法同粪便等样品。3.涂抹标本：使用无菌棉签涂抹3～5只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品、餐饮人员、餐具等表面，直接接种到10mL碱性蛋白胨水，37℃增菌培养8～12h，划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养，同样的菌膜下培养物再吸0.2～0.1mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养8～12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方法同粪便等样品。4.固体食品样品：取25-50克标本放入碱性胨水中增菌培养，标本与碱性胨水的比例为1：5。增菌培养方法与以上水样及液态食品相同。（四）鉴定分型1玻片凝集试验：①01、0139群霍乱弧菌初步鉴定：挑取上述可疑菌落与01群、0139霍乱弧菌单克隆抗体做玻片凝集试验。如可疑菌落很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告：样品中未检出01、0139群霍乱弧菌。②分纯：用接种环取抗原抗体复合物接种于普通营养琼脂板上分纯，37℃过夜培养。③复核及分型：挑取分纯后的可疑菌落和纯培养物。01、0139群霍乱弧菌用诊断血清和单克隆抗体复核。01群霍乱弧菌分型使用小川型及稻叶型的单价血清和单克隆抗体做玻片凝集反应，同时用生理盐水做对照。与小川型单价血清和单克隆抗体凝集、与稻叶型单价血清和单克隆抗体不凝集者为小川型。与小川型单价血清和单克隆抗体不凝集、与稻叶型单价血清和单克隆抗体凝集者为稻叶型。与小川型、稻叶型单价血清和单克隆抗体均呈明显凝集者为彦岛型。PCR技术测定霍乱毒素基因，从而辅助鉴定O1群菌种。（五）血清学检查血清学检查适用于有典型霍乱症状但粪便霍乱弧菌培养阴性者。有助于流行病学追溯诊断，检查的成分为抗菌抗体。为进行血清学诊断，需要采取病人的双份血清，在发病第1～3天采第一份血清，第15～20天采第二份血清。检查血清中抗菌抗体常用凝集试验和杀弧菌试验杀弧菌试验比凝集试验敏感。1.试管凝集试验：用生理盐水对倍连续稀释待检血清，每管含稀释血清0.5mL。将标准菌在营养琼脂上的16～18h培养物用0.2％福尔马林生理盐水制成约含18亿菌/mL(相当于细菌标准比浊管浓度)的悬液，每稀释血清管加0.5mL；另将菌悬液加入0.5mL生理盐水中作对照。摇匀，置37℃3h观察初步结果，再放冰箱(4℃)或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为＋＋，以能使菌呈＋＋凝集的血清最高稀释度判为血清凝集效价。第二份血清效价比第一份血清增长4倍或以上者有诊断意义。2.杀弧菌抗体检测：可采用改良微量法，检测程序如下：①2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液(TTC)的配制：用无菌蒸馏水配制0.5％(W/V)溶液，加热溶解，置灭菌棕色瓶中，4℃保存备用。②补体指示菌混悬液制备：选取标准01群及0139群霍乱弧菌为指示菌，分别连续在营养琼脂平板上分离2次，选取光滑型菌落2～3个，挑取小量接种于5mL营养肉汤中，37℃培养6h，取0.1mL转种于5mL营养肉汤，37℃培养2h，用分光光度计测定492nm吸光度(OD)值，调整OD值至0.1为原液。将原液作1∶50稀释后与1∶10补体等量混合，即为补体指示菌混悬液。⑤观察结果：以孔内无颜色变化的血清最高稀释度为被检测标本的杀弧菌抗体滴度，第二份血清效价比第一份血清升高8倍或以上者有诊断意义。六.实验室质量控制1.用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上