生长与环境条件

生长与环境条件第1页/共81页微生物的分离和纯培养无菌技术用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞(单孢子)分离选择培养分离二元培养物微生物的保藏技术

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长第2页/共81页一、无菌技术

在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique).

它是保证微生物学研究正常进行的关键。第

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长第3页/共81页微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culturedish，petridish)

灭菌，不含任何生物。培养基在器皿中灭菌，也可单独灭菌后加入无菌的器具中。高压蒸汽灭菌高温干热灭菌第

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长第4页/共81页防止杂菌污染棉花塞，金属、塑料及硅胶帽，空气通过，微生物不能通过。平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。第

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长第5页/共81页接种操作技术用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养。微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行。第

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长第6页/共81页二、用固体培养基分离纯培养菌落或菌苔大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，平板分离法利用固体培养基让孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成便于移植的菌落，进而得到纯培养。第

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长什么是纯培养？p197第7页/共81页所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。第

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长第8页/共81页稀释倒平板法(pourplatemethod) 涂布平板法(spreadplatemethod) 平板划线分离法(streakplatemethod)稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod)第

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长第9页/共81页稀释倒平板法

取样---系列稀释---混菌---培养---单菌落(可能是由一个细菌细胞繁殖形成的)---挑取单菌落，或重复操作---纯培养。涂布平板法无菌平皿---无菌平板---稀释样品悬液---涂布---培养---单菌落

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长第10页/共81页第11页/共81页平板划线分离法

待分离材料---平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线(微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来)---培养---单菌落。第

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长第12页/共81页第13页/共81页第14页/共81页稀释摇管法

对氧气更为敏感的厌氧性微生物的分离则可采用稀释摇管培养法进行。将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后，冷却并保持在50℃左右，用这些试管进行梯度稀释待分离材料，试管均匀，冷凝，倾注一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间，挑取和移植单菌落。第

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长第15页/共81页第16页/共81页三、用液体培养基分离纯培养

接种物在液体培养基中依序稀释，以达高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果稀释后的多数试管微生物不生长，则有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。第

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长第17页/共81页四、单细胞(单孢子)分离

采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。难度用途第

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长第18页/共81页五、选择培养分离通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。可利用选择培养基进行直接分离或富集培养。第

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长选择培养基？富集培养基？第19页/共81页利用选择培养基进行直接分离主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，得到纯培养物。富集（选择）培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集（选择）条件温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养第

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长第20页/共81页六、二元培养物

只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径。第

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长第21页/共81页七、微生物的保藏技术传代培养保藏冷冻保藏干燥保藏法第

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长第22页/共81页菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。保藏技术的要求(不死亡，不污染，不变异)菌种或培养物保藏的重要性第

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长第23页/共81页菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，美国典型菌种保藏中心(ATCC)，世界菌种保藏联合会(WFGC)。第

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长第24页/共81页传代培养保藏常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种。传代培养十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化。第

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长第25页/共81页冷冻保藏使微生物处于冷冻状态，代谢作用停止以达到保藏的目的。微生物细胞对低温敏感，可用速冻、快速升温和添加各种保护剂等手段。液氮保藏或-70℃低温保藏。用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。第

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长第26页/共81页干燥保藏法水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。第

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长第27页/共81页沙土管保存

主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等。

将菌种接种培养，长出大量的孢子，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。第

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长第28页/共81页冷冻真空干燥保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，经真空冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。第

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长第29页/共81页细胞生长到一定阶段，开始细胞分裂产生子代细胞，从而促使个体数目增加，这就是繁殖。在适宜的环境中，微生物按自己的代谢方式，进行同化作用和异化作用，如果同化作用大于异化作用，则细胞中新合成的物质就会增加，细胞的体积逐渐增大，这就是生长。第二节生长的定义与测定方法微生物生长与繁殖的定义第30页/共81页

微生物的生长实质上包含了微生物群体中个体数量和质量的增长

“微生物生长＝生长＋繁殖”第31页/共81页

细菌细胞的生长和繁殖是不易分开的。它包括细胞长大，细胞壁增生，DNA复制，横隔壁的形成，子细胞的产生。一、细菌生长的定义和测定方法(一)细菌生长、繁殖纯培养第32页/共81页(二)细菌生长的测定方法1.细胞数量的测定(1)总细胞计数法血球计数板涂片计数法：0.01ml样品第33页/共81页血球计数板第34页/共81页1mm大方格中小大方格：高0.1mm第35页/共81页一个大方格中的总菌数(即0.1mm3中的总菌数)为(A/5)×25×B，因1ml=1cm3=1000mm31ml菌液中的总菌数=A5×25×10×1000×B=50000A×B(个)A：五个中方格中总菌数；B：菌液稀释倍数。第36页/共81页选用450-650nm波段光密度值控制在0.1-0.65之间，有较高的精确度透光度光密度(2)比浊法与血球板计数法及平板活菌计数法相结合第37页/共81页(2)比浊法与血球板计数法及平板活菌计数法相结合第38页/共81页

(3)活菌计数法涂布平板法混合倒平板法第39页/共81页

细胞干重法含氮量测定法细菌的含氮量为干重的12.5%2.细胞生物量的测定DNA含量测定法第40页/共81页二、细菌的群体生长曲线

当把少量纯种单细胞微生物接种于恒容积的液体培养基后，在适当的温度、通气等条件下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如果以时间为横坐标，以细胞数目的对数为纵坐标，就可画出由延迟期、对数期、稳定期和衰老期4个阶段组成的类似S型的曲线，这种曲线称为微生物的典型生长曲线。第41页/共81页56789延迟期对数期衰老期稳定期时间活菌数目的对数\mL第42页/共81页(一)延迟期细胞不分裂，但细胞变大；细胞内RNA含量增高而使原生质呈碱性；合成代谢活跃，易合成新的诱导酶；对外界环境变化敏感。延迟期的长短与菌种本身、菌龄、接种量及培养基有关。缩短延迟期方法第43页/共81页细菌数目以几何级数增加，酶系活跃，代谢旺盛，大小均匀。在生长曲线上，表现为一条上升的直线。(二)对数期t1t0N0NtNt=N0×2nn=(lgNt-lgN0)/lg2G=(t1-t0)/n第44页/共81页影响代时的因素菌种营养成分(营养物种类以及浓度)培养温度第45页/共81页一些微生物的代时细菌种类 培养基培养温度 代时

(℃) （分）E.coli

肉汤 37 17E.coli

牛奶 37 12.5产气肠杆菌 肉汤,牛奶 37 16—18产气肠杆菌 合成培养基 37 29—44嗜热芽孢杆菌 肉汤 55 18.3B.subtilis

肉汤 25 26—32嗜酸乳杆菌 牛奶 37 66—87乳酸链球菌 牛奶 37 26乳酸链球菌 乳糖肉汤 37 48第46页/共81页新繁殖的细胞与死亡细胞数目几乎相等，处于动态平衡。菌体产量达到最高，细胞开始储藏糖原、脂肪等储藏物。产芽孢。开始合成次生代谢产物。(三)稳定期延长方法：补料、调节pH、温度或通气量第47页/共81页活菌数目急剧下降；出现了“负生长”；细胞形态多样，有时产生畸形；细胞开始自溶，释放次生代谢产物。(四)衰亡期第48页/共81页二次生长、同步生长、连续培养真菌生长第49页/共81页第三节环境条件对微生物生长的影响一、温度二、水和渗透压三、酸碱度四、氧和氧化还原电位五、辐射六、化学杀菌剂和抑菌剂第50页/共81页温度生长速率最低最适最高一、温度第51页/共81页一、温度(一)微生物生长的温度类型嗜冷微生物(最适<20℃，最低<0℃)嗜温微生物(最适为25~40℃)嗜热微生物(最适>40℃)(二)低温对微生物的影响(三)高温对微生物的影响——灭菌1.干热灭菌2.湿热灭菌常压法煮沸100℃15’间歇灭菌:2×90℃，25’巴氏消毒加压法常规加压灭菌法:121℃,30’连续加压灭菌法:140℃,15’’62.8℃30’71.7℃15”第52页/共81页二、水和渗透压(一)水活度(αw)

是一种反映环境中水对微生物生长可给性高低的指标。是指在相同温度下，溶液或物质表面空气的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比。αw=Ps/Pw第53页/共81页二、水和渗透压(一)水活度(αw)0.6~0.98及课本表7-3第54页/共81页二、水和渗透压(一)水活度(αw)第55页/共81页二、水和渗透压(二)渗透压

当两种不同浓度的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势的推动而透过隔膜流向浓溶液，直至浓溶液所产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。细胞膜是一个具有特殊结构和功能的半透性膜。第56页/共81页二、水和渗透压(二)渗透压微生物细胞渗透压环境渗透压水微生物细胞渗透压环境渗透压水质壁分离应用，例外10-15%盐，50-70%蔗糖原生质球破裂第57页/共81页三、酸碱度大多数细菌：pH6.5~7.5放线菌：微碱性真菌：偏酸微生物最适pH:第58页/共81页三、酸碱度t第59页/共81页三、酸碱度第60页/共81页四、氧和氧化还原电位(一)氧与微生物的生长大多数细菌、几乎所有放线菌、蓝细菌、丝状真菌等许多数细菌、酵母菌、病原微生物一些乳酸菌(如嗜盐片球菌)梭状芽孢杆菌双歧杆菌属的某些种第61页/共81页(一)氧与微生物的生长四、氧和氧化还原电位专性厌氧微生物不能清除氧的代谢产物----超氧阴离子及过氧化氢，受它们的毒害而死亡。第62页/共81页大宝SOD蜜，内含丰富的SOD活性物质，并加入人参、黄芪等天然植物的有效成人它极易被皮肤吸收，并在皮肤表面形成一层保护膜，有效地防止角质水份的散失。经常使用大宝SOD蜜，能祛除色素、黑斑、消除皱纹、延缓衰老。全家适用，四季皆宜。SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD，具有抗衰老的特殊效果。“要想皮肤好，早晚用大宝”第63页/共81页四、氧和氧化还原电位(Eh)(二)氧化还原电位(Eh)与微生物的生长Eh值与“O2含量及是否存在氧化还原物质有关”通常环境中的Eh值在+800mV与-450mV之间。在培养基中加入还原剂来降低Eh值，满足厌氧微生物的生长。第64页/共81页如何培养厌氧菌呢？需特殊的培养装置以保持厌氧环境，及还原性的培养基(1)高层琼脂柱(2)厌氧培养皿(3)亨盖特滚管技术(4)厌氧罐(5)厌氧手套箱第65页/共81页高层琼脂柱NaOH溶液焦性没食子酸亨盖特滚管技术含还原剂试管口和试管腔体积很小第66页/共81页将产气袋剪去一角并注入适量水后投放入厌氧罐，反应后形成CO2和H2钯催化H2与O2反应形成水美蓝从有氧时的蓝色变成无氧时的无色第67页/共81页N2:CO2:H2=85:5:10(V/V)第68页/共81页五、辐射(一)紫外线：100nm~40