生物技术制药05抗体制药

生物技术制药05抗体制药第1页/共111页抗体制药主要内容免疫学基础知识抗体（免疫球蛋白）的结构单克隆抗体及其制备基因工程抗体的制备抗体诊断试剂和治疗药物要求掌握抗体、基因工程抗体的概念和结构掌握单克隆抗体和基因工程抗体制备的思路和方法第2页/共111页抗体制药免疫学基础知识免疫系统（immunesystem）机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统免疫系统的构成免疫组织和器官中枢免疫组织和器官外周免疫组织和器官免疫细胞固有免疫的组成细胞适应性免疫应答细胞免疫分子与抗原分子免疫球蛋白、补体、细胞因子等第3页/共111页抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官骨髓（bonemarrow）人体极为重要的造血器官和免疫器官各类血细胞和免疫细胞发生的场所B细胞、NK细胞分化成熟的场所体液免疫应答发生的场所第4页/共111页抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官第5页/共111页抗体制药免疫组织和器官中枢免疫组织和器官胸腺（thymus）

T细胞分化、发育、成熟的场所。从骨髓迁入的淋巴样祖细胞，在胸腺特定的环境中，经过复杂的分化和发育过程，最终成为功能性CD4+T细胞及CD8+T细胞，输出胸腺，定位于外周淋巴器官和组织。第6页/共111页抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官淋巴结（lymphnode）广泛存在于全身非黏膜部位的淋巴通道上，人体全身约有500～600个，一般群集在外源物质容易入侵的部位成熟T细胞和B细胞定居的主要场所，其中T细胞约占淋巴结内细胞总数的75%，B细胞占25%免疫应答发生的场所参与淋巴细胞的再循环淋巴结内的巨噬细胞能吞噬、清除抗原性异物，发挥过滤作用第7页/共111页抗体制药免疫组织和器官淋巴结（lymphnode）第8页/共111页抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官脾（spleen）

T细胞和B细胞定居的场所（B细胞60%，T细胞40%）免疫应答发生的场所合成并分泌某些重要的生物活性物质，如补体成分过滤、清除血液中的异物，净化血液第9页/共111页抗体制药免疫组织和器官外周免疫组织和器官黏膜免疫系统（mucosalimmunesystem）主要存在于呼吸道、肠道及泌尿生殖道等部位人体黏膜表面积约400m2病原微生物等异源物质入侵机体的主要门户，因此，黏膜系统是人体重要的防御屏障机体近50%的淋巴组织存在于黏膜系统，因此黏膜系统又是发生局部特异性免疫应答的主要部位可以产生分泌型IgA第10页/共111页抗体制药免疫组织和器官黏膜免疫系统口腔上皮组织呼吸道上皮组织肠表皮组织子宫颈表皮组织第11页/共111页抗体制药免疫细胞固有免疫与适应性免疫细胞第12页/共111页抗体制药免疫细胞固有免疫（innateimmunity）

——生物体与生俱来的防御机制，可对入侵的病原体迅速作出应答，产生非特异抗感染免疫作用固有免疫的组成细胞吞噬细胞（phagocytes）单核吞噬细胞（mononuclearphagocytes）中性粒细胞（neutrophil）树突状细胞（dendriticcell）NK细胞（naturalkillercell）嗜酸性粒细胞（eosinophil）嗜碱性粒细胞（basophil）和肥大细胞（mastcell）第13页/共111页抗体制药免疫细胞巨噬细胞（macrophage）巨噬细胞是最重要的一种吞噬细胞，属于单核吞噬细胞类定居型巨噬细胞清除体内衰老损伤或凋亡的细胞，清除抗原性异物游走型巨噬细胞细胞质内含有大量溶酶体，具有强大的吞噬微生物、吞噬清除体内凋亡细胞及其他异物的能力巨噬细胞的主要功能吞噬、清除抗原性异物参与、促进炎症反应加工提呈抗原，启动适应性免疫应答第14页/共111页抗体制药免疫细胞巨噬细胞（macrophage）第15页/共111页抗体制药免疫细胞自然杀伤细胞（NK细胞，naturalkillercell）来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育和成熟依赖于骨髓和胸腺微环境主要分布于外周血和脾不表达特异性抗原识别受体，但可表达多种表面标志无需抗原预先致敏，可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞

NK细胞激活后，可分泌IFN-、IL-2和TNF等细胞因子，发挥免疫调节作用第16页/共111页免疫细胞自然杀伤细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用抗体制药第17页/共111页抗体制药免疫细胞适应性免疫（adaptiveimmune）

——体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程适应性免疫应答细胞

T淋巴细胞（Tlymphocyte）

B淋巴细胞（Blymphocyte）第18页/共111页抗体制药免疫细胞T淋巴细胞（T细胞）来源于骨髓中的淋巴样祖细胞，在胸腺中发育成熟T细胞表面具有许多重要的膜分子，参与T细胞识别抗原，以及T细胞的活化、增殖、分化及效应功能的发挥第19页/共111页抗体制药免疫细胞T细胞与HIVT细胞表面的CD4分子是HIV壳膜蛋白gp120受体，与CD4分子结合是HIV入侵并感染CD4+T细胞的重要机制第20页/共111页抗体制药免疫细胞B淋巴细胞（B细胞）B细胞产生特异的免疫球蛋白，特异性地与抗原结合B细胞表面有众多膜分子，对B细胞识别抗原，以及激活、增殖、产生抗体、加工提呈抗原给T细胞发挥重要作用第21页/共111页抗体制药免疫分子与抗原分子抗原抗体——免疫球蛋白补体系统第22页/共111页抗体制药免疫分子抗原（antigen，Ag）能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质特征1：具有免疫原性——抗原进入机体内，能促使机体产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性特征2：具有抗原特异性——能选择性地与某种抗体结合并发生作用完全抗原同时具有免疫原性和抗原特异性的物质不完全抗原或半抗原（hapten）只能与特定的抗体作用但不引起机体免疫应答的简单分子第23页/共111页抗体制药免疫分子抗原的异物性异物性是抗原免疫原性的本质抗原与机体之间的亲缘关系越远，组织结构差异越大，异物性就越强，其免疫原性就越强抗原的特异性某一特定抗原只能刺激机体产生特定的抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该抗体或对该抗原应答的淋巴细胞有特异性结合抗原表位（antigenepitope）抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇（antigenicdeterminant）能与抗体分子结合的抗原表位的总数称为抗原结合价天然抗原一般是大分子，含多个表位，是多价抗原第24页/共111页抗体制药免疫分子抗原分子的理化性质对抗原免疫原性的影响一般蛋白质是良好的抗原，而脂类和哺乳动物细胞核成分（如DNA、组蛋白等）一般不诱导免疫应答抗原的分子量越大，含有抗原表位越多，结构越复杂，则免疫原性越强（一般大于100kDa的为强抗原）蛋白分子中含有较多的芳香族氨基酸，则免疫原性较强蛋白质的构象及氨基酸所处侧链的位置不同可影响抗原与淋巴细胞中受体的结合，从而影响抗原的免疫原性一般聚合状态的蛋白质较其单体有更强的免疫原性第25页/共111页抗体制药免疫分子抗体（antibody，Ab）抗体是机体经抗原刺激，由免疫细胞产生的一组免疫球蛋白具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应功能：防御外界物质对机体的侵袭最常用的抗体是免疫球蛋白G（IgG），它在血清免疫球蛋白中的含量最高，约占70%第26页/共111页抗体制药免疫分子补体（complement,C）系统存在于血清、组织液和细胞膜表面的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，包括30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白补体成分均为糖蛋白，多属球蛋白，少数为及球蛋白肝细胞和巨噬细胞是补体的主要生成细胞在生理情况下，血清中大多数补体成分均以无活性的酶前体形式存在。当前一组分被激活，即具备了裂解下一组分的活性，由此形成一系列放大的级联反应第27页/共111页抗体制药免疫分子补体的生物学作用参与宿主早期抗感染免疫溶解细胞、细菌和病毒促进吞噬细胞的吞噬作用引起炎症反应维护机体内环境稳定清除免疫复合物和凋亡的细胞参与适应性免疫参与免疫应答的诱导和调节参与免疫细胞的增殖、分化参与免疫记忆第28页/共111页抗体制药抗体（免疫球蛋白）的结构免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的类型免疫球蛋白的功能人工抗体第29页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）可分为分泌型（secretedIg，sIg）和膜型（membraneIg，mIg），前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能，后者构成B细胞膜上的抗原受体免疫球蛋白由四条肽链组成，各肽链间有数量不等的链间二硫键结构上可分为三个长度大致相同的片段，形成一Y字形结构，称为Ig单体，构成免疫球蛋白分子的基本单位第30页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构第31页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构重链（heavychain，H）由450～550个氨基酸残基组成，分子量50～75kDa轻链（lightchain，L）由214个氨基酸残基构成，分子量约25kDa轻链有链和链两种，一个天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同的，但同一个体内可存在分别带有链和链的抗体分子，其比例具有种属特异性第32页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构可变区（variableregion，V区）轻链和重链中靠近N-端氨基酸序列变化较大的区域重链和轻链的V区分别称为VH和VL分别占重链和轻链的1/4和1/2VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（CDR），共同组成Ig的抗原结合部位在V区中CDR之外的区域氨基酸组成和序列相对不变，称为骨架区（FR）第33页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构抗体的互补决定区（CDR）与抗原表位结合示意图第34页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构恒定区（constantregion，C区）靠近C-端氨基酸序列相对稳定的区域重链和轻链的C区分别称为CH和CL分别占重链和轻链的3/4和1/2不同型Ig的CL长度基本一致，但不同类IgCH的长度不一第35页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构Ig的结构域两条重链和轻链均可折叠成数个球形结构域，每个结构域约由110个氨基酸残基构成二级结构由反向平行的两个-片层（-sheet）组成，两个-片中心的两个Cys由一个链内二硫键垂直连接，形成“-桶状（-barrel）”结构，这种折叠方式称为“免疫球蛋白折叠（immuno-globulinfolding）”第36页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构铰链区（hingeregion）位于CH1与CH2之间含有丰富的Pro易伸展、弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段第37页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段第38页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解片段水解部位是Ig铰链区二硫键连接的两条重链在近N-端，可将Ig裂解为两个完全相同的Fab片段和一个Fc片段Fab片段即抗原结合片段（fragmentantigenbinding），由一条完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成，为单价抗体片段，可与抗体结合，但不凝集Fc片段即可结晶片段（fragmentcry-stallizable），相当于IgG的CH2和CH3结构域，无抗原结合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位第39页/共111页抗体制药免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶水解片段作用于铰链区二硫键所连接的两条重链的近C-端，水解后可获得一个F(ab')2片段和一些小片段pFc'F(ab')2片段由两个Fab及铰链区组成，是双价抗体片段，可同时结合两个抗原表位，可发生凝集反应和沉淀反应F(ab')2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了Fc片段免疫原性可能引起的副作用，广泛用作生物制品第40页/共111页抗体制药免疫球蛋白的分类类（class）同一种属的所有个体内，Ig重链C区所含抗原表位不同，据此可将重链分为、、、、链五种，与此对应的Ig分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE亚类（subclass）同一类免疫球蛋白其重链的抗原性及二硫键数目和位置不同，据此可将Ig分为各个亚类IgG的四个亚类：IgG1～IgG4IgA的两个亚类：IgA1、IgA2第41页/共111页抗体制药免疫球蛋白的分类型（type）同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区所含抗原表位的不同，可将Ig轻链分为和两种，与此对应的Ig分为和两型亚型（subtype）同一型免疫球蛋白中，根据其轻链C区N-端氨基酸排列的差异，分为各种亚型例如，链190位氨基酸为Leu时称OZ(+)，为Arg时称OZ(-)第42页/共111页抗体制药免疫球蛋白类型与、、、、五种重链相对应的Ig分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE第43页/共111页抗体制药免疫球蛋白类型IgGIgG约占血清中总Ig的75%～80%，是血清中含量最高的Ig，在体内分布广泛，是再次免疫应答产生的主要抗体半衰期20～23天人IgG有四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4IgG1～3可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用IgG1、IgG2和IgG4可通过其Fc片段与葡萄球菌蛋白A结合，用于纯化抗体，并用于免疫诊断第44页/共111页抗体制药免疫球蛋白类型IgM占血清免疫球蛋白总量的5%～10%，血清浓度约1mg·ml-1单体IgM以膜结合型（mIgM）表达于B细胞表面，构成B细胞抗原受体（BCR）分泌型IgM为五聚体，是分子量最大的Ig，不能透过血管壁，主要存在于血液中天然的血型抗体为IgM，血型不符的输血可导致严重溶血反应IgM是个体发育中最早合成和分泌的抗体（胚胎发育晚期）初次体液免疫应答中最早出现的抗体第45页/共111页抗体制药免疫球蛋白类型IgAIgA分为两型：血清型和分泌型血清型IgA为单体，占血清Ig总量的10%～15%分泌型IgA（sIgA）为二聚体，由J链连接sIgA是外分泌液中的主要抗体类别，参与黏膜局部免疫，在黏膜表面有中和毒素的作用第46页/共111页抗体制药免疫球蛋白类型IgD仅占血清Ig总量的0.2%，血清中浓度约30g/mlIgD铰链区较长，易被蛋白酶水解，半衰期仅3天分为血清型和膜结合型，前者功能尚不清楚，后者构成BCR，是B细胞发育成熟的标志IgEIg中含量最低，血清中浓度仅0.05g/ml特征为糖基含量高达12%IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关第47页/共111页抗体制药免疫球蛋白的功能IgV区的功能识别并特异性结合抗原，其中CDR部位在识别和结合特异性抗原中起决定性作用不同类的Ig由于抗原结合价不同，结合抗原的能力也不同IgG：双价sIgA：4价五聚体IgM：理论上为10价，但由于立体结构的空间位阻，仅表现为5价第48页/共111页抗体制药免疫球蛋白的功能IgC区的功能激活补体人IgG1～3和IgM与抗原结合后，构象改变，其CH2/CH3结构域内的补体结合点暴露，从而激活补体系统IgM、IgG1和IgG3补体激活能力较强，IgD不激活补体结合Fc受体IgG和IgE可通过其Fc片段与表面具有相应受体的细胞结合，产生调理、细胞毒性及超敏反应等生物学作用穿过胎盘和黏膜IgG是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白，有助于新生儿抗感染sIgA可通过呼吸道和消化道黏膜，在黏膜局部免疫中起重要作用第49页/共111页抗体制药人工抗体从血清中获取抗体，因来源有限，而且需要大量的血清，成本较高，远远不能满足研究和治疗的需求人工制备抗体是大量获得抗体尤其是治疗性抗体的有效途径人工抗体的主要类型多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体第50页/共111页抗体制药人工抗体多克隆抗体（polyclonalantibody，PAb）天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体，也称常规抗体，简称多抗获取多抗的主要途径是动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制备容易缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而限制了其应用第51页/共111页抗体制药人工抗体单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）1975年，Köhler和Milstein将可产生特异性抗体的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合，建立了杂交瘤细胞技术，可生产McAb（简称单抗）每个杂交瘤细胞由一个B细胞和骨髓瘤细胞融合，因每个B细胞克隆仅识别一种抗原表位，故经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌单一抗原表位的特异性抗体，即McAbMcAb解决了多克隆抗体特异性不高以及交叉反应等缺点，结构均一，纯度高，效价高缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复使用可产生人抗鼠的免疫应答第52页/共111页抗体制药人工抗体多抗和单抗示意图第53页/共111页抗体制药人工抗体基因工程抗体利用DNA重组技术，将编码人源抗体的基因克隆到特定的表达系统中，进行体外表达而得的的人-鼠嵌合抗体或人源化抗体基因工程抗体设计的出发点是解决抗体的鼠源性问题基因工程抗体既保持了McAb的均一性、特异性好的特点，又能克服其鼠源性的不足缺点：亲和力较弱，效价偏低第54页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备动物免疫杂交瘤细胞的制备杂交瘤细胞的筛选和鉴定单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的纯化第55页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备动物（小鼠）免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫化学合成抗原：如地高辛（强心苷）部分纯化的抗原（混合物）为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体应使用同一品系动物进行免疫目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系致敏的免疫缺陷小鼠1972年由Bazin和Beckers培育成的浆细胞瘤高发系。特征：回盲部淋巴结产生一种自发性淋巴瘤（免疫细胞瘤），70％的免疫细胞瘤可分泌单克隆免疫球蛋白，Lou/C大鼠广泛用于免疫学研究,尤其是单克隆抗体制备。第56页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备动物免疫的方法体内免疫法通常指皮下、肌肉及腹腔注射免疫免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔，进行初次免疫可溶性抗原按每只小鼠10～100g抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，最大限度刺激B细胞增殖、分裂脾内免疫（B细胞约占60%）第57页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备动物免疫的方法体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；或抗原的免疫源性极弱，易引起免疫抑制时使用方法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5g/ml，在5%CO2，37oC下培养4～5天，再分离脾细胞，进行细胞融合优点：所需抗原量少，一般只需数微克；免疫期短，仅4～5天；干扰因素较少缺点：构建的杂交瘤细胞株不够稳定第58页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的制备

——骨髓瘤细胞的选择在杂交瘤细胞技术中，主要使用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细胞是由抗体合成细胞克隆衰变而成的肿瘤细胞尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好融合时，活细胞数应至少大于90%第59页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备常用骨髓瘤细胞系全名

简称

来源

耐受

表达自身Ig分子

P3-X63-Ag8

X63

BALB/c小鼠

8-Ag

Ig-1·

MOPC11-X45-6TG

X45

BALB/c小鼠6-TG

Ig-2

b

P3-NS1-Ag4.1

NS-1

BALB/c小鼠8-Ag

(非分泌型)

P3-X63-Ag8.653

P3.653

BALB/c小鼠8-Ag

—

SP2/0-Ag14

SP2/0

BALB/c小鼠8-Ag

—

Fast-Zero

FO

BALB/c小鼠8-Ag

—

Y3-Ag1,2,3

Y3

Lou

大鼠

8-Ag

链

YB2-3.0-Ag20

YB2

(Lou×AO)F1

8-Ag

—

8-Ag：8-氮杂鸟嘌呤；6-TG：6-巯基嘌呤第60页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的制备——免疫脾细胞悬液的制备取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，用NH4Cl破碎红细胞，洗涤，调整细胞至所需浓度，备用杂交瘤细胞的制备——骨髓瘤细胞悬液制备收集经传代生长24h的骨髓瘤细胞，洗涤后，计数，备用第61页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的制备——细胞融合脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2～3×107）混合加入PEG诱导融合，时间控制在2min以内用培养液将PEG融合液缓慢稀释细胞融合的注意点脾B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比例一般为(5～10)：1PEG的分子量：一般选择4000～6000，浓度40～50%在PEG溶液中加入DMSO，可以提高细胞接触的紧密性，提高融合率应严格限制PEG、DMSO和细胞接触的时间第62页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的筛选筛选之前的细胞混合液中含有多种细胞未融合的细胞：脾细胞、瘤细胞融合的细胞：脾—脾、瘤—瘤、脾—瘤筛选：HAT选择性培养基含次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）氨基喋呤阻断DNA合成途径，瘤—瘤细胞不能合成DNA而死亡脾细胞在一般条件下不能连续培养，亦很快死亡骨髓瘤细胞是HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺乏细胞株，而脾细胞内含有HGPRT，因此杂交瘤细胞可利用H、A和T合成DNA而得以生长第63页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的筛选——选择性培养方法将融合细胞悬浮于HAT培养液中，加入到含有饲养细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板内，每2～3天换液一次换液时取出1/2～2/3培养液，加入等量的新鲜培养液细胞融合后一周内用HAT培养液，杀死杂细胞后，第二周改用HT培养液（不含A）从第三周起改用普通的RPMI1640完全培养液从细胞融合后8～9天起可对上清进行抗体检测，筛选阳性克隆第64页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的筛选——筛选阳性克隆筛选要求：微量、快速、特异、敏感、简便，可一次性检测大批标本常用方法：免疫分析法，如ELISA

将抗原固定在微孔板上，细胞培养上清培育一定时间后，用酶标的抗鼠二抗，通过酶促反应底物颜色变化，了解是否含有针对该抗原的抗体存在。第65页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的克隆化克隆化：使单个细胞通过无性繁殖而获得该细胞群体的整个培养过程，这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同原因：筛选出的阳性克隆中，大多数情况下产生抗体的杂交瘤集落不是来自单个细胞，其中可能混有不分泌抗体的细胞，这种细胞比分泌抗体的细胞生长快，容易占据优势；此外，刚融合的杂交瘤细胞不稳定，染色体易丢失一般融合后的杂交瘤细胞要经过三次左右的的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆第66页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备克隆化方法——有限稀释法将杂交瘤细胞悬液稀释至一定浓度，加入到96孔培养板中，使每个孔中的细胞尽可能为单细胞，经过一段时间培养最终形成细胞克隆可在光学显微镜下观察到细胞分裂，直至细胞集落形成克隆化方法——软琼脂培养法将一定浓度的待克隆细胞与2%琼脂糖培养液混合，铺于底部含有1%琼脂糖培养液平皿的上部，待单细胞集落生长至1～2mm时，用毛细管吸取单集落，转移到细胞培养板中培养工作效率高，一次克隆化即可获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，但对操作熟练程度要求高第67页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞库的建立第一次融合的细胞在每次克隆过程中，均应对检测阳性的细胞扩大培养，冻存一定量的细胞经3～4次克隆，100%杂交瘤细胞孔为分泌抗体阳性细胞时，扩大培养，冻存较大量的细胞，建立较完整的原始细胞库原始细胞库中的细胞应包括原始融合细胞、每次克隆的细胞及建株的细胞，且建株细胞的溯源应明确原始细胞库中的建株细胞经扩大培养，再建立一个工作细胞库，用于日常研究和生产第68页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的鉴定1——染色体分析目的：杂交瘤细胞在有丝分裂过程中有丢失染色体的倾向，而当杂交瘤细胞丢失携带抗体产生基因的染色体时分泌抗体的能力也会消失方法：细胞处于分裂中期时分析，此时染色体长短和大小比较适合。采取分裂阻抑的方法使细胞多处于分裂中期，细胞经低渗处理，将染色体固定于载玻片上，显微镜下观察，计数结果：正常小鼠脾细胞染色体数40条；SP2/0细胞一般为62～68条；NS-1细胞一般为54～64条，因此杂交瘤细胞染色体数应在90～110条之间第69页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的鉴定2——分泌抗体稳定性分析分泌抗体能力稳定性是杂交瘤细胞的一项重要指标。如果发现抗体分泌能力下降，应对杂交瘤细胞进行再克隆，直至100%培养孔细胞上清液抗体分泌呈阳性抗体连续传代法：将细胞在体外培养，定期传代，收集细胞上清液，筛选上清中的抗体稳定性测定一般需连续传代3个月以上第70页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备杂交瘤细胞的鉴定3——外源因子检查无菌试验检查杂交瘤细胞中的细菌残留支原体检查杂交瘤细胞制备过程中，脾细胞制备、体外连续传代以及培养液中的血清都有感染支原体的可能；人体体表、口腔和空气中亦存在大量支原体支原体污染细胞后，在培养、传代过程中不易被发现鼠源病毒检查骨髓瘤细胞往往呈某些病毒阳性，如鼠白血病病毒阳性制备免疫脾细胞的小鼠如非SPF级别，往往也带有某些病毒第71页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的大量制备——动物体内诱生法研究和诊断用的McAb多采用此法生产，所得McAb的量较多（5～20mg/ml），效价较高往小鼠腹腔内注射降植烷（或液体石蜡），破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境具体方法接种杂交瘤细胞前1～2周，小鼠腹腔注射降植烷0.5ml，而后注射1×106个杂交瘤细胞生成腹水（一般在接种后7～12天）后，抽取，离心去除细胞，取上清液冻存反复操作数次，可获得较多的抗体第72页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的大量制备——体外培养法治疗性抗体多用此法生产，产量约10μg/ml悬浮培养采用RPMI1640培养液，添加10～20%胎牛血清悬浮培养的细胞密度可达2×107/ml，McAb为0.4mg/ml固定化培养——微载体悬浮培养采用DEAE-SephadexA50等微粒材料作为细胞固定化载体，增大比表面积，细胞密度可达108/ml，McAb的浓度显著提高第73页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的纯化不同类和亚类的Ig其纯化方法存在差别——在选择分离纯化方法之前应明确Ig的类和亚类抗体的用途不同，其纯化的方法亦不同，对其质量控制的要求也不同——用于体外诊断的试剂，对纯度和杂质的要求稍低——用于体内诊断和治疗性抗体，对纯度和杂质要求相当高，必须除去病毒、核酸、内毒素等微量污染物第74页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的纯化小鼠腹水的处理和抗体捕获先中、低速离心去除腹水中的细胞、细胞碎片、纤维代表凝块、脂质等沉淀物高速离心去除残留的小颗粒物质0.2μm微孔滤膜过滤，除去可能的污染物（细菌、支原体等）饱和(NH4)2SO4沉淀抗体，离心，收集沉淀，可回收90%以上的抗体第75页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的纯化凝胶过滤用于IgG和IgM类McAb的分离纯化，常用SephadexG200为分离介质抗体回收率50～80%，纯度可达95%以上，能去除微量杂蛋白阴离子交换层析用于IgG类McAb的纯化，常用DEAE型弱阴离子交换剂pH=5.5时上柱，抗体与介质结合，除去较多杂蛋白pH=7.4时IgG1和IgG2能结合在DEAE基团上IgG2a可在低离子强度下洗脱，纯度较高IgG2b和IgG3在提高离子强度时洗脱第76页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的纯化亲和层析ProteinA层析法为最常用，特别适用于IgG类单抗的纯化pH值决定IgG与ProteinA的结合程度，采用不同pH值的缓冲液可以选择性洗脱不同亚类的IgG收获抗体的纯度很高ProteinA亲和介质价格较昂贵第77页/共111页抗体制药单克隆抗体及其制备单克隆抗体的纯化疏水性电荷诱导层析（HCIC）HCIC介质配基中的硫原子对Trp和Phe等氨基酸有特殊的亲和力，因此HCIC配基能与抗体的Fc片段特异性结合吡啶和咪唑等杂环在pH4～10范围内不带电荷，减少了静电对杂质的吸附；当pH值降到小于配基的pKa时，杂环质子化，此时抗体也带有正电荷，产生静电排斥第78页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备基因工程抗体的特点最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应分子较小，在组织中的透过率增大，穿透力强，更易到达病灶的核心部位可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量生产，显著降低成本第79页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备免疫球蛋白的基因——多基因决定型L链：3段基因编码V

基因：1～95位（95个）氨基酸J

基因：96～108位（13个）氨基酸C

基因：109～214位（105个）氨基酸型L链：V、J、C基因交叉排列H链：4段基因编码VH基因DH（多样性）基因JH

基因CH

基因第80页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备人免疫球蛋白基因的结构第81页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备免疫球蛋白基因的编码和表达第82页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备基因工程抗体的种类人－鼠嵌合抗体CDR移植抗体小分子抗体Fab抗体FV抗体单链抗体单域抗体分子识别单位多功能抗体第83页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备基因工程抗体的类型与特性类型

基本结构

相对分子质量

人－鼠嵌合抗体

人IgC－小鼠IgV

150kDa

改形抗体

小鼠CDR替换人CDR

150kDa

Fab

完整L链和Fd

50kDa

FV

VH

和

VL

25kDa

单链抗体（scFV

）

VH

－连接肽－VL

27kDa

单域抗体

VH

或

VL

12.5kDa

分子识别单位（MRU）

一个CDR

<2kDa

第84页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备人－鼠嵌合抗体 （human-mousechimaricantibody）鼠源性V区+人源性C区设计思路Ig分子的C区决定了其异种抗原性Ig分子的V区几乎不产生免疫原性将鼠源性McAb的C区用人Ig分子的C区替换，则McAb对人的免疫原性大大减小第85页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备人－鼠嵌合抗体的构建可变区（V区）基因克隆——逆转录法提取杂交瘤细胞的mRNA，逆转录成cDNA以cDNA为模板，采用特异性引物，PCR扩增VL和VH基因表达载体的构建将VL和VH基因分别连接真核表达系统所需的转录元件将VL基因克隆到人IgCL的基因表达载体上；将VH基因克隆到人Igg1的C基因真核表达载体上将人－鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0转染后用霉酚酸进行筛选，筛选出形成集落的细胞第86页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备人－鼠嵌合抗体的构建第87页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备CDR移植抗体 （CDRgraftingantibody，改形抗体）用人的CDR替换小鼠McAb中的CDR设计思路Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是VH

和VL区中的6个CDR区，而非整个可变区框架区主要起支持CDR的作用，氨基酸组成和立体结构较为保守抗体中鼠源部分比例很小，基本消除免疫原性第88页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备CDR移植抗体的构建第89页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备CDR移植抗体的构建原则在选择骨架区（FR区）时，从已知的人源抗体V区数据库中选择与亲本抗体同源性最高的序列，最大可能地维持原抗体的天然构象，提高CDR移植抗体的亲和性将FR区内可能影响抗原结合部位的氨基酸残基替换为亲本鼠单抗的氨基酸残基选择性地保留CDR两侧的FR区序列抗体V区的N-末端，特别是轻链N-末端的数个氨基酸残基应选择性地一同移植第90页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备CDR移植抗体的构建方法全合成法将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，即可用于构建和表达改形抗体定点突变法将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体第91页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备小分子抗体FVScFV单域抗体分子识别单位FabIgG第92页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备Fab抗体包含完整的轻链和一半长度的重链（VH+CH1+VL+CL）通过木瓜蛋白酶水解得到，链间含有二硫键占完整抗体分子大小的1/3，具有一个抗原结合位点重组Fab抗体C区改用人源化片段，V区为鼠源性片段，降低免疫原性第93页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备FV抗体抗体可变区片段（VH+VL）抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段VH

和VL

通过非共价键结合，容易解离抗体片段小，约为全分子的1/6，透过性好第94页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备单链抗体（singlechainFV，scFV）用一段弹性连接肽（linker）将抗体VH

和VL

通过共价键连接Linker的长度一般为15个氨基酸残基，常用的氨基酸序列为(Gly—Gly—Gly—Gly—Ser)3scFV的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法，合成linker的基因，将VH

和VL

基因连接分子小，容易进入组织，易于改造；体内半衰期短，免疫原性较低稳定性依然不高，且亲和力较低第95页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备单域抗体（single-domainantibody）只由一个结构域构成的抗体片段，即VH

或VL，常用VH约为完整抗体分子长度的1/12亲和力远小于FV，但保留了抗原结合活性分子识别单位 （molecularrecognitionunit，MRU）也称最小识别单位，约为完整分子的1/80～1/70抗原特异性结合能力主要由CDR3决定，由此构建的CDR3小肽仍具有抗原结合能力，但亲和力很低CDR3第96页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备多功能抗体双功能抗体多功能抗体抗体融合蛋白第97页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备双功能抗体双特异性单链抗体 （bispecificsingle-chainFVs，bisFVs）将A抗原的抗体VL区基因（VLA）与B抗原的抗体VH区基因（VHB）通过短核苷酸序列（短肽连接子）连接并表达而得，连接肽长度一般为5个氨基酸残基（GGGGS）能同时识别2种抗原，1种为对应肿瘤相关抗原，另1种为对应效应成分，可对肿瘤细胞进行杀伤和裂解第98页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备多功能抗体scFV的多聚体第99页/共111页抗体制药基因工程抗体的制备抗体融合蛋白：广义上属于双功能抗体配基－配基型融合蛋白配基－Ig型嵌合蛋白配基－FV型融合蛋白受体－FV型融合蛋白酶－抗体型融合蛋白第100页/共111页抗体制药抗体诊断试剂和治疗药物诊断试剂根据抗原－抗体之间的反应现象（如凝集、沉淀），利用已知抗体鉴定抗原，作出病原诊断血清学鉴定免疫标记导向