中和试验文档

中和试验中和试验中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。所属分类：免疫学概述动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验(NeutralizationTest)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。两种试验方法介绍中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。(一)定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变10514155/68310541511/617105501000/100105501500/150LD50的计算：按Reed和Muench氏法计算。高于50%的死亡分数-50%83%-50%距离比例=────────────────────=──────=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%－17%LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5则LD50=10，0.03ml，即该病毒作10稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。注意：稀释血清法中和试验，计算TCID50或LD50，MID50时，计算公式应改为：TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。如按Karber氏法计算，其公式为：IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)=－6.5则LD50=10，0.03ml注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。(2)EID50的测定（以新城疫病毒为例）将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算EID50。(3)TCID50的测定（以致细胞病变病毒为例）取新鲜病毒悬液，以10倍递次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，加入维持液，置37℃培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID50。2.中和试验(1)病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如病毒的毒价为10，则试验组选用10－10对照组选用10－10其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。(2)血清处理用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。(4）感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放37℃感作12h。(5)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物（或鸡胚、组织细胞）。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。(6)中和指数据计算物按Reed和Muench两氏法（或Karber）法分别计算试验组和对照组的LD50（或EID50、TCID50）试验级LD50(EID50、TCID50)中和指数=──────────────────对照组LD50(EID50、TCID50)假如试验组LD50为10，对照组LD50为10。则中和指数为10，10=1995，也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。(7)结果判定固定血清―稀释病毒法进行中和试验，当中和指数大于50，表示补检血清中有中和抗体；中和指数在10-50为可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。(二)固定病毒-稀释血清法（血清中和试验）1.病毒毒价的测定（微量法）(1)病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。(2)病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10，10，10……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID50。56%-50%距离比例=────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。表2-25TCID50计算（接种剂量50μl）病毒稀释度接种数CPE数无CPE数累计CPE率百分数(%)CPE无CPE1088039039/391001088031031/311001087123123/24961085315415/19791084410810/1856108446126/1833108262182/2010108080260/260IgTCID50=－6+0.26×(－1)=－6.3则TCID50=10，50即病毒作10稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。2.中和试验(1)血清的处理动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。(2)稀释血清取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。(3)病毒取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量血清混合，其毒价为100TCID50）。如本例病毒价为10，50μl。所以应将病毒作2×10稀释。(4)感作每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。病毒与血清混合，0℃下，不发生中反应，4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h，一般病毒都可发生充分的中和反应。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。(5)加入细胞悬液在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO237℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14h终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。(6)设立对照为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。0.1TCIDTCID50应不引起细胞病变，而且100TCIDTCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。(7)结果判定和计算当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，如表2-2680%－50%距离比例=──────=0.580%－20%IgTCID50=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数IgTCID50=－1.2－0.5×（－0.3）=－1.05表2-26固定病毒－稀释血清法中和抗体效价计算血清稀释CPE数总孔数CPE数无CPE数积累CPE比率保护率CPE无CPE1:4(10)0/4040120/121001:8(10)0/404080/81001:16(10)1/413141/5801:32(10)3/431414/5201:64(10)4/440808/80则TCID50=10，50μl因10=1/11，即1:11稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE影响中和试验的因素：(1)病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用100-500TCID50。(2)用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。(3)细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。(4)毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。试验应用1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性：毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。

中和试验检测应用病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。本试验主要用于：（1）从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；（2）用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；（3）测定抗病毒血清或抗毒素效价；（4）新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。1、血清中和实验鉴定新城疫血清中和实验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体，以确定鸡群是否感染过新城疫。中和实验可以在鸡胚或细胞培养以及易感鸡中进行。方法是：在鸡新城疫免疫血清（或待检血清）中，加入一定量的待检病毒（或已知病毒），两者混合均匀后，接种10～11日龄的SPF鸡胚，或鸡胚成纤维细胞，或有易感性的鸡，并设立不加血清的病毒对照。结果注射血清和病毒混合材料的鸡胚或鸡不死亡，鸡胚成纤维细胞无病变，而对照组死亡或细胞培养出现病变，则肯定为新城疫病毒。2、血清中和实验诊断猪瘟将不同稀释度的血清与已知浓度的稀释病毒混合，再接种细胞培养物进行培养，18-24h后进行荧光抗体检查；或与猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）中和，接种到兔中观察兔体温反应，以此确定血清的终点滴度。在西欧最常用的方法是过氧化物酶中和实验（NPLA），而在一些北美洲和拉丁美洲国家则多使用免疫过氧化物酶单层实验（1PMA）方法。3、血清中和实验检测猪繁殖与呼吸综合征一般来说，在群体水平上血清学诊断易操作，特异性强，敏感性高。但对个体的检测则比较困难，有时出现非特异性反应，但可以在2～3周后取样复测解决此问题。血清学检测一般用吸附实验（如IPMA、IF、ELISA），这些实验常用某种抗原型的病毒进行，对其他抗原异型病毒抗体的灵敏度较低。应用抗体结合试验，在病猪感染了7～14天检出抗病毒抗体，30～50天抗体滴度出现高峰。有些在病猪感染后3～6个月内血清转为阴性，有些病猪血清阳性维持较久。中和抗体在病猪感染后出现较慢，但滴度不高。可在感染后3-4周检测到中和抗体，这种抗体能维持1年或更长时间。有报道，在血清中和实验中使用补体能提高试验的灵敏度。关于病猪感染后血清阳性持续时间的长短，目前尚未进行广泛深入的研究，因其有可能随实验方法不同而异。母源抗体半衰期为12～14天，一般仔猪在出生后4～8周内可检测到病毒，随母猪生产时的滴度及所用试验方法而异。在污染的环境中，血清学检测为阳性的母猪所产仔猪能在3～6周龄时血清转为阳性。应用巨噬细胞分离病毒以及利用两类血清型病毒的IPMA在实验室容易操作，这种试验可用MARC-145细胞系增殖欧洲型病毒和美洲型病毒操作。使用MARC-145细胞系做间接免疫荧光实验（1FA）能顺利进行PRRSV血清学反应。目前，灵敏度高、特异性强商品化的ELISA试剂盒已经上市。同时，国内学者还开发了乳胶凝集试剂盒，可用于PRRSV抗体快速监测。血清中和实验检测PR