酶的生物合成法生产

酶的生物合成法生产第1页，共106页，2023年，2月20日，星期三

第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成

遗传信息传递的中心法则转录传递给RNA，再由RNA

蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA

第2页，共106页，2023年，2月20日，星期三核酸是生物遗传的物质基础,蛋白质是生命活动的体现者.DNA子代DNA信使RNA蛋白质

复制转录翻译密码蛋白质生物合成依赖核酸正常功能,核酸生物合成及基因表达的调节需要蛋白质参与.第3页，共106页，2023年，2月20日，星期三（一）RNA的生物合成--转录(transcription)定义:以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。遗传信息:DNA片段中的核苷酸排列顺序.分类:mRNAtRNArRNA特点:以DNA双链中的一条链的某个片段为模板.有意义链:有指导转录作用的一条DNA链.反意义链:无转录功能的一条DNA链.第4页，共106页，2023年，2月20日，星期三转录模板

启动子（promoter)

终止子(terminator)模板链（templattestrand）反意义链(antisensestrand)有意义链(sensestrand)非信息区DNA5´5´3´3´第5页，共106页，2023年，2月20日，星期三TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶反意义链有意义链RNAPPi5’5’5’3’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’第6页，共106页，2023年，2月20日，星期三RNA的转录过程(三步)1.起始2.延长3.终止

转录合成的RNA是rRNA、tRNA、mRNA的前体,还需经过加工修饰后才具有生物学功能.第7页，共106页，2023年，2月20日，星期三

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）

起始因子第8页，共106页，2023年，2月20日，星期三RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA

启动子（promoter)

终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开第9页，共106页，2023年，2月20日，星期三Thebasicprincipleoftranscription第10页，共106页，2023年，2月20日，星期三RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链有义链模板链（反义链）延长部位第11页，共106页，2023年，2月20日，星期三翻译:以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。mRNA蛋白质翻译

各种信息各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)第12页，共106页，2023年，2月20日，星期三

mRNA

是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。氨基酸密码

mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息,称为密码子（codon）或三联体密码。第13页，共106页，2023年，2月20日，星期三

四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子.其中:1.一个起始密码:AUG

位于mRNA的5’末端,并兼作蛋氨酸的密码.2.三个终止密码:UAAUGAUAG

位于mRNA的3’末端3.多数氨基酸拥有2-4个密码.

第14页，共106页，2023年，2月20日，星期三tRNA

tRNA是氨基酸的转运工具,能携带活化的氨基酸到核蛋白体。

tRNA有特异性,至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码,能与mRNA上相应的密码互补结合(碱基互补配对)。

第15页，共106页，2023年，2月20日，星期三酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码与反密码的碱基配对第16页，共106页，2023年，2月20日，星期三rRNArRNA与蛋白质组成核蛋白体,是蛋白质合成的场所.由大小两个亚基组成:小亚基:与mRNA结合,沿5’3’

方向移动.大亚基:受位(A位):结合氨基酰-tRNA给位(P位):成肽第17页，共106页，2023年，2月20日，星期三AUGACA5’蛋苏UGUGUU3’受位(A位)给位(P位)大亚基小亚基第18页，共106页，2023年，2月20日，星期三

蛋白质的合成过程

（大肠杆菌）

氨基酸的活化肽链合成的起始肽链的延伸肽链合成的终止与释放第19页，共106页，2023年，2月20日，星期三氨基酸的活化与转运反应式：AA+tRNA+ATP氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA+AMP+PPi

对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第20页，共106页，2023年，2月20日，星期三核蛋白体循环（三阶段）1、起始阶段2、延伸阶段3、终止阶段第21页，共106页，2023年，2月20日，星期三肽链合成的起始阶段1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：

30S-mRNA-IF3

fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。3.大小亚基结合IF130S起始复合物第22页，共106页，2023年，2月20日，星期三AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亚基mRNA蛋氨酰tRNAGTP大亚基GDP+Pi受位给位蛋蛋肽链合成的起始阶段第23页，共106页，2023年，2月20日，星期三肽链合成的延伸阶段1.进位:氨基酰-tRNA进入受位;2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。第24页，共106页，2023年，2月20日，星期三AUGACA5’3’UAC蛋苏UGUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’蛋苏UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始复合体进位转肽移位Mg+K+第25页，共106页，2023年，2月20日，星期三肽链合成的终止阶段1.出现终止密码并与终止因子结合;2.肽键水解,多肽释放;3.tRNA,mRNA,大小亚基解离.

第26页，共106页，2023年，2月20日，星期三AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’终终AUGUAA5’UAC3’终5’3’UAC终肽链第27页，共106页，2023年，2月20日，星期三第28页，共106页，2023年，2月20日，星期三肽链合成后的“加工处理”N端改造fMet的切除信号肽（signalpeptide）的切除肽链中氨基酸残基的化学修饰乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化4.切除前体中功能不必需肽段

某些多肽要经特殊的酶切一段肽链后才有生物活性(如：胰岛素)5.肽链的折叠6.二硫键的形成第29页，共106页，2023年，2月20日，星期三二、酶生物合成的调节

转录水平的调节是酶生物合成中最重要的调节，是一种在基因水平上的代谢调节。与调节酶活性的反馈抑制相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。第30页，共106页，2023年，2月20日，星期三定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。第31页，共106页，2023年，2月20日，星期三

操纵子——基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质,struturalgene,S）控制部位操纵基因（operatorgene,O）启动子（promotorgene,P）（一）基因调控理论

JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）诱导型操纵子：只有当存在诱导物时，转录频率才最高乳糖操纵子阻遏型操纵子:只有当缺乏辅阻遏物时,转录频率才最高

色氨酸操纵子第32页，共106页，2023年，2月20日，星期三基因操纵子调节系统示意图

调节基因

启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白

蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子第33页，共106页，2023年，2月20日，星期三

调节基因(regulatorgene)：

可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)

（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。第34页，共106页，2023年，2月20日，星期三cAMP-CRP复合物的作用示意图

启动基因（promotergene）（启动子）：有两个位点：

（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

第35页，共106页，2023年，2月20日，星期三操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Struturalgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。第36页，共106页，2023年，2月20日，星期三(二)酶合成调节的类型

1.诱导

(induction)

组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

2.阻遏

(repression)

分解代谢物阻遏(cataboliterepression)

反馈阻遏(feedbackrepression)第37页，共106页，2023年，2月20日，星期三（三）酶合成的调节机制

1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。第38页，共106页，2023年，2月20日，星期三乳

糖

操

纵

子

的

负

调

控调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖

阻遏蛋白（有活性）诱导第39页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.末端产物阻遏

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

酶合成阻遏的现象：

实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则:不需要就不合成。第40页，共106页，2023年，2月20日，星期三

色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达第41页，共106页，2023年，2月20日，星期三酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物第42页，共106页，2023年，2月20日，星期三调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比第43页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。第44页，共106页，2023年，2月20日，星期三分解代谢物阻遏现象：

实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。

这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。第45页，共106页，2023年，2月20日，星期三乳糖操纵子的正调控——分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态第46页，共106页，2023年，2月20日，星期三三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）

1.诱变育种

(1)使诱导型变为组成型（消除对诱导剂的依赖）

——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株

2.基因工程育种

第47页，共106页，2023年，2月20日，星期三（二）条件控制1.添加诱导物

酶的作用底物（或底物前体）

诱导物分三类酶的反应产物酶的底物类似物（最有效）2.降低阻遏物浓度

除去终产物产物阻遏添加阻止产物形成的抑制剂避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富添加一定量的cAMP第48页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.促进分泌（添加表面活性剂）

离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80

非离子型增加细胞通透性

TritonX－1004.添加产酶促进剂

产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度。第49页，共106页，2023年，2月20日，星期三

第二节酶发酵动力学

研究内容：研究发酵过程中细胞的生长速率，产物的形成速率以及环境因素对这些速率的影响。即研究生物反应速度的规律。意义：更加深入地认识和掌握发酵过程，为工业发酵的模拟、优化和控制打下基础。研究方法：用数学模型定量描述。第50页，共106页，2023年，2月20日，星期三一、细胞生长动力学内容：研究细胞生长速率及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。目的：使细胞生长速度维持在一定范围内，以达到较为理想的效果。

第51页，共106页，2023年，2月20日，星期三

细胞生长曲线

O-A延迟期

A-B指数生长期

B-C减速期

C-D静止期

D-E衰亡期

在分批培养(batchculture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。第52页，共106页，2023年，2月20日，星期三

营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型µ:比生长速率（1/h）（specificgrowthrate）即每单位数量的细菌或物质在单位时间内（h）增加的量µmax：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度）克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数克/L，或mol/L第53页，共106页，2023年，2月20日，星期三第54页，共106页，2023年，2月20日，星期三Ks是使µ达到最大比生长率µmax值一半时的营养物浓度（限制基质浓度）。当一种限制性营养物浓度S大大低于Ks时，µ=µmaxS/Ks，即µ很小，此时生长很慢。当S=Ks时，µ=0.5µmax，随营养物浓度增加，µ相应增加，逐渐趋向µmax，µ成为营养物浓度的重要函数，此时营养物浓度仍是生长的限制因素，在Monod模型上表现为曲线。当S无限大时，µµmax，理论上最大潜力。第55页，共106页，2023年，2月20日，星期三当营养物浓度S大大高于Ks时，营养物浓度不再影响微生物生长，即S的变化不再成为生长限制因素，此时，µ接近µmax，在Monod曲线上表现为直线。在分批培养时，Ks表示微生物对营养物的亲和力，Ks越小，微生物对限制性营养物的亲和力越大，限制性营养物的浓度必须降低到十分低的水平，才能影响微生物的生长，Ks越大，亲和力越小，即使限制性营养物浓度很高，生长率也下降。第56页，共106页，2023年，2月20日，星期三

一些微生物的µmax和Monod饱和常数微生物生长限制基质µmaxKsE.Coli葡萄糖0.852.0-4.0E.Coli乳糖20酿酒酵母葡萄糖0.1325木霉菌葡萄糖0.1343.2产脘假丝酵母氧0.440.03产脘假丝酵母甘油4.5第57页，共106页，2023年，2月20日，星期三

二、产酶动力学

（一）酶生物合成的模式

根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：同步合成型生长偶联型中期合成型部分生长偶联型延续合成型非生长偶联型滞后合成型第58页，共106页，2023年，2月20日，星期三1.生长偶联型（又称同步合成型）

酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。第59页，共106页，2023年，2月20日，星期三生长偶联型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。第60页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.部分生长偶联型（又称延续合成型）

酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。第61页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.非生长偶联型（又称滞后合成型）

只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这易类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。第62页，共106页，2023年，2月20日，星期三总结：影响酶生物合成模式的主要因素高：可在细胞停止生长后继

1）mRNA的稳定性续合成酶差：随着细胞停止生长而终止酶的合成2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。第63页，共106页，2023年，2月20日，星期三

酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。第64页，共106页，2023年，2月20日，星期三(二)产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中X——细胞浓度(g/L)

——细胞比生长速率(h-1) ——生长偶联的比产酶系数(IU/g) ——非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh))E——酶浓度(IU/L)t——时间(h)第65页，共106页，2023年，2月20日，星期三生长偶联型部分生长偶联型

非生长偶联型

第66页，共106页，2023年，2月20日，星期三

第三节微生物发酵产酶概念：利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程。现状：大多数酶采用微生物细胞进行发酵生产。原因：微生物研究历史长，且具有种类多、易培养、代谢能力强等特点。第67页，共106页，2023年，2月20日，星期三

已发现的酶近3000种应用于工业、医药、遗传工程、分析研究领域的酶有2500种工业生产商品酶50-60种大规模工业生产的有10多种研究用商品酶300-400种第68页，共106页，2023年，2月20日，星期三一、产酶微生物的分离和选育1.产酶菌种应具备的条件（优良产酶菌种的标准）（1）酶产量高（2）易培养（生长速率高、营养要求低）（3）遗传性能稳定，不易退化（4）易分离提纯（5）安全可靠（不是致病菌）第69页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.常用的产酶微生物EscherichiacoliPseudomonasBacillussubtilisMicrococcusStreptococcusStreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaeMonascusPenicilliumTrichodermaRhizopusMucorAbsidia

SaccharomycescerevisiaeCandida第70页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.微生物发酵产酶方法固体培养:特别适合于霉菌培养液体培养:目前酶发酵生产的主要方式固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器

第71页，共106页，2023年，2月20日，星期三

细菌-淀粉酶的生产（液体深层发酵）工艺流程：斜面菌种孢子悬液种子扩大培养罐发酵热处理盐析压滤干燥粉碎成品霉菌-淀粉酶的生产（固体曲）工艺流程：斜面菌种三角瓶菌种种曲厚层通风培养粉碎抽提过滤沉淀压滤烘干等第72页，共106页，2023年，2月20日，星期三4.微生物酶的类型（1）胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。（2）胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。第73页，共106页，2023年，2月20日，星期三5.产酶微生物的分离和筛选

1)样品的采集

2)富集培养添加特殊的营养物质调整培养基的酸碱性控制培养温度和热处理添加抑制剂

3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）

4)初筛选出产酶菌种，以多为主

5)复筛选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。酶活测定方法的建立尤其重要。第74页，共106页，2023年，2月20日，星期三

-淀粉酶的筛选第75页，共106页，2023年，2月20日，星期三蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基第76页，共106页，2023年，2月20日，星期三6.产酶微生物优良菌种的选育诱变育种原生质体融合育种基因工程育种第77页，共106页，2023年，2月20日，星期三酶发酵生产的一般工艺流程

第78页，共106页，2023年，2月20日，星期三三、发酵工艺条件及其控制

1.细胞活化与扩大培养

2.培养基的配制

3.pH值的调节控制

4.温度的调节控制

5.溶解氧的调节控制第79页，共106页，2023年，2月20日，星期三

在影响的诸多因素中，营养条件最为重要

1）营养物种类：要考虑碳源对酶生物合成的调节作用，如产生诱导作用还是分解代谢物阻遏作用。

2）营养物比例：

C/N比不当,影响菌体对按比例吸收营养物

改变原来合适的pH环境

氮源不足，表现为菌体繁殖慢，

碳源不足，表现为菌体容易衰老3）营养物浓度：对易被吸收的限制性营养物浓度控制为充足而不过大。第80页，共106页，2023年，2月20日，星期三第四节动、植物细胞培养产酶与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。

第81页，共106页，2023年，2月20日，星期三动物细胞模式图第82页，共106页，2023年，2月20日，星期三植物细胞结构第83页，共106页，2023年，2月20日，星期三

植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等第84页，共106页，2023年，2月20日，星期三三者之间的差异主要有：植物细胞>动物细胞>微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。第85页，共106页，2023年，2月20日，星期三一、植物细胞培养产酶

1.植物细胞培养的特点

以往提取法的缺点：①提取工艺复杂；②植物的栽培和生长受地理环境和气候条件的影响；③易破坏野生植物资源，影响生态环境。利用植物细胞发酵产酶的优点：

①提高产率、缩短周期。②易于管理，减轻劳动强度。③提高产品质量。第86页，共106页，2023年，2月20日，星期三2.培养基植物细胞培养基与微生物培养基的不同点在于：（1）植物细胞的生长代谢需要大量的无机盐。包括N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素，Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种微量元素。（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源。（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源。第87页，共106页，2023年，2月20日，星期三应用最广的是MS培养基和LS培养基

MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。组分MS培养基（ml/L）碳源大量元素微量元素铁盐维生素pH值蔗糖30g/LMS1100MS210MFe液10MB＋液105.7MS培养基组成第88页，共106页，2023年，2月20日，星期三3.培养方法植物细胞的大规模培养方式为悬浮细胞培养。与微生物发酵一样，包括三个步骤：①细胞株的建立，包括外植体的选择与处理，愈伤组织的培养，愈伤组织经单细胞分离出的优良无性繁殖系，经摇瓶培养所得的游离细胞，供作种子；②扩大培养；③大罐培养；有分批培养法、半连续培养法和连续培养法。第89页，共106页，2023年，2月20日，星期三外植体：外植体是从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：将上述植外体植入诱导培养基中，于25℃左右，培养一段时间，即从外植体的切口部位长出小细胞团，此细胞团称为愈伤组织。第90页，共106页，2023年，2月20日，星期三水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织外植体愈伤组织第91页，共106页，2023年，2月20日，星期三4.培养条件的影响与控制（1）温度：一般控制在室温范围（25℃左右）。（2）pH：一般控制在微酸性范围，即pH5～6。

（3）通气与搅拌：适当。（4）光照的控制：对光照强度、时间、波长有一定的要求。（5）前体的添加（饲喂）：增加次级代谢产物的产率。（6）诱导子（elicitors）的应用：强化次级代谢物的生物合成。第92页，共106页，2023年，2月20日，星期三5.植物细胞培养产酶实例以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在4℃冰箱中放3周，以打破休眠。去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。第93页，共106页，2023年，2月20日，星期三(2)大蒜悬浮细胞培养

将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（苄基腺嘌呤）的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。第94页，共106页，2023年，2月20日，星期三(3)酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。第95页，共106页，2023年，2月20日，星期三二、动物细胞培养产酶

1.动物细胞培养的特点主要用于各种功能蛋白质的生产，如激素、酶、疫苗等。动物细胞的生长速度