自动化PCR-Free解决方案的特点与应用优势

———自动化PCR-Free解决方案的特点与应用优势

常规高通量测序的文库构建，需要PCR扩增。主要是为了对微量DNA样本进行扩增，提高库容；另一方面，放大核酸荧光信号，提高测序准确度。然而，PCR扩增同样也有着无法忽视一些问题：扩增过程中产生复制错误，累积下去，产生假阳性；扩增会有一定的偏好性，比如GC含量异常的区域和二级结构等区域，扩增效率低，难以覆盖；扩增的循环数越多，重复率（Duplication）越高，造成测序成本增加、浪费测序数据。

什么是PCR-Free技术

常规扩增建库有诸多问题，那么PCR-Free技术也就营运而生。PCR-Free技术，相较于常规建库，其建库步骤为：基因组片段化-末端修复-加接头-纯化-文库质控，省去了PCR扩增的步骤。PCR-Free建库技术：省去扩增步骤，缩短建库时间；避免使用高保真聚合酶，降低建库成本；减少扩增产生的复制错误；避免扩增偏好性；避免扩增产生的Duplication，降低测序成本。

lluminaDNAPCR-FreePrep，TagmentationDNA建库即运用了PCR-free的建库方式，并同时采用创新型链接在磁珠上的转座酶（BLT），将接头连接和DNA片段化结合到一个简单快速的反应中，实现WGS高度均匀的覆盖。

针对PCR-Free建库方法，我们推出了基于Biomeki7工作站的IlluminaDNAPCRfree文库构建自动化方案，该方案可使用低投入量（25-99ng）或标准投入量（100-2000ng）gDNA进行建库，同时进行96例样本的建库。减少手动操作时间减少系统设置何潜在的移液错误标准化工作流程改进实验结果快速安装

Biomeki7工作站

图1.Biomeki7HybridGenomicsWorkstation工作桌面集成了96通道移液头与灵活8通道移液头；灵活8通道可配置固定针和可替换吸头通道搭配；96通道可选择上一列、一行、多行等不规则形状排列吸头，实现不定样本数液体转移；斜侧抓板机械手可360度旋转，轻松实现台面全覆盖；多达45个工作板位；可实现震荡、加热/冷却、吸头清洗等功能；开放式工作桌面，可轻松整合外部设备，如（自动PCR仪）。

图2.IlluminaPCRfreeDNALibraryPrep自动化工作流

使用Biomeki7工作站进行IlluminaPCRfree文库构建，轻松解放双手，把更多的活交给工作站来进行

表1.Biomeki7HybridGenomicsWorkstation自动化IlluminaPCRfree流程预估时间（大于100nggDNA投入）

MethodOptionsSelector(MOS）

MOS能够选择样本数量、投入量、Index开始使用位置，以最大限度地提高灵活性、适应性和方法执行的简易性。

图3.IlluminaPCR-Free建库方法选项选择器

GuidedLabwareSetup(GLS)

GLS基于MOS中选择的选项生成的，并提供用户特定的图形设置说明，包括试剂体积计算和准备试剂的分步说明。

图4.引导式实验室设置提供配方解释，指示试剂量（上图），

并指导用户正确设置平台（下图）

DeckOptixFinalCheck(DFC)

在开始运行自动化流程之前，BML中的DFC功能，会通过实时拍照的方式分析工作桌面耗材摆放，以减少设置错误，例如吸头、深孔板摆放位置错误。实验设计

为了证明在i7双杂交工作站上进行96个样品文库制备的能力，我们从人细胞系NA12878gDNA制备文库。将起始浓度为150ng、300ng、400ng、500ng和750ng的48个gDNA样本以及阴性模板对照（NTC）随机放入96孔板，如下所示。实验结果随机挑取了23个gDNA文库进行测序，平均插入片段为483bp28bpReadsmapping率为96.8%，标准偏差为0.1%

Biomeki7工作站上的IlluminaPCRfreeD