(3.6)-药敏试验卫生微生物检验实验方法与技能

抗菌药物敏感性试验【实验目的】掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作方法等、结果判断、意义及质量控制；熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及意义等；了解药敏试验的质量控制。【实验内容】纸片扩散法肉汤稀释法2023/4/154【实验器材与试剂】菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌药物：青霉素、庆大霉素纸片和药液培养基：MH肉汤和MH平板其他：无菌10ml试管、无菌移液管、无菌棉签、试管架、酒精灯等一、纸片扩散法（K-B法）1.原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。抑菌圈

含药纸片

2.培养基和抗菌药物纸片抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，厚1mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片。培养基：水解酪蛋白（M-H）琼脂，倾注直径为90mm的平板，厚度4±0.5mm。①平板制备：将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。②菌液准备：从平板上无菌挑取4～5个菌落，置无菌生理盐水，混匀制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。3.实验方法比浊法调整菌液浓度③涂布接种：用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60°）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。④贴药敏纸片：平板室温放置3～10分钟干燥。用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应＞24mm，纸片距平板内缘应＞15mm。注意根据菌株挑选相应的抗菌纸片肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素；铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平。2023/4/1512⑤孵育：35℃培养16～18h，对苯唑西林和万古霉素等敏感应培养24h。⑥质量控制：标准菌株的抑菌圈直径应在预期范围内。如超出范围，视为失控不发报告，须查找原因，予以纠正。2023/4/15142023/4/1515标准菌株的抑菌圈预期值范围抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm）大肠埃希菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC25923铜绿假单胞菌ATCC27853阿米卡星30μg19~2620~2618~26庆大霉素10μg19~2619~2717~23青霉素10IU—26~37—氨苄西林10μg16~2227~35—哌拉西林100μg24~30—25~33头孢噻肟30μg29~3525~3118~22亚胺培南10μg26~32—20~28红霉素15μg—22~30—环丙沙星5μg30~4022~3025~33

量取抑菌环直径（mm)，根据CLSI（clinicalandlaboratorystandardsinstitute）标准，报告细菌对该抗生素：

敏感(susceptible,S):使用常规推荐剂量治疗时，在感染部位所达到药物浓度可抑制分离菌株生长。

耐药(resistant,R)：使用常规推荐剂量治疗时，在感染部位所达到药物浓度不能抑制分离菌株生长。

中介(intermediate,I)：最小抑菌浓度接近药物的血液或组织浓度，疗效低于敏感菌；可作为敏感和耐药的缓冲区，减少实验条件失控导致结果解释偏差。4.结果判断和报告

金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果抗菌药物纸片含药量

抑菌圈直径(mm)

相应MIC值(μg/ml)耐药中介敏感耐药中介敏感青霉素10IU≤28-≥29≥0.25-≤0.12万古霉素30μg---≥164~8≤2庆大霉素10μg≤1213～14≥15≥168≤4红霉素15μg≤1314～22≥23≥81~4≤0.5克林霉素2μg≤1415～20≥21≥41~2≤0.5环丙沙星5μg≤1516~20≥21≥42≤1

大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验评价结果抗菌药物纸片含药量

抑菌圈直径(mm)

相应MIC值(μg/ml)耐药中介敏感耐药中介敏感氨苄西林10IU≤1314~16≥17≥3216≤8哌拉西林100μg≤1718~20≥21≥12832~64≤16庆大霉素10μg≤1213～14≥15≥168≤4头孢噻肟15μg≤1314～22≥23≥81~4≤0.5环丙沙星5μg≤1516～20≥21≥42≤1亚胺培南10μg≤1920~22≥23≥42≤1二、肉汤稀释法1.原理以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素做不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。①试管编号：取26支试管排成两排（测试菌排，质控菌排），每排13支编号。另取3支试管，分别标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”和“质控菌生长对照”等。2.方法（宏量肉汤稀释法）2.方法（宏量肉汤稀释法）②抗菌药物稀释：按照常用抗菌药物容积稀释法稀释药物。将药物原液稀释到待测最高浓度，如128μg/ml。除每排第一支试管外，每支试管内加M-H肉汤2ml。每排的第一、二管分别加入2ml抗菌药物，依次对倍稀释到第13管，各管中抗菌药物的终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06和0.03μg/ml。2023/4/15231234567891011121312345678910111213肉汤对照测试生长对照质控生长对照肉汤药液弃掉2ml弃掉2ml测试菌质控菌③菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到107cfu/ml；④菌液接种：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低到高加于各排试管中，其最终的接种量为5×105cfu/ml。测试菌排、测试菌生长对照管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照管加质控菌液。⑤孵育：35℃培养16~20h，观察结果。2.方法（宏量肉汤稀释法）测试菌（或质控菌）不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌（质控菌）的MIC。根据MIC判定耐药、敏感和中介。3.结果（宏量肉汤稀释法）培养基质量、接种细菌的菌量、抗菌药物的配制、孵育温度和观察时间、操作是否规范等均能影响本试验的结果。为保证结果的可靠性，需同时采用相应标准菌株同时进行药敏试验作为质量控制的方式。4.注意事项【