维生素的生产

维生素的生产第1页，共25页，2023年，2月20日，星期二学习目标了解维生素C的性质及生物合成工艺原理；熟悉莱氏法生产维生素C的生产工艺；掌握两步发酵法生产维生素C的生产工艺。第2页，共25页，2023年，2月20日，星期二第一节

概述应用:维生素C（VitaminC，VC）又名抗坏血酸，化学名称为L-2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-γ-内酯。是人体不可缺少的要素，维生素C是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。其结构式为：

性质：维生素C是一种白色或略带淡黄色的结晶或粉末，无臭、味酸、遇光色渐变深，水溶液显酸性。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等有机溶剂。水溶液在pH为5~6之间稳定，若pH值过高或过低，并在空气，光线和温度的影响下，可促使内酯环水解，并可进一步发生脱羧反应而成糠醛，聚合易变色。第3页，共25页，2023年，2月20日，星期二第二节合成原理莱氏法

德国的莱奇登（Reichstein）等人以D-山梨醇为原料，经黑醋菌（AcetobacterMelanogenum）一步发酵得L-山梨糖，将此糖在酸性条件下，经丙酮酮醇缩合，得双丙酮糖，再经次氯酸钠（或高锰酸钾）氧化得双丙酮-2-酮-L-古龙酸，再将后者水解去丙酮后经盐酸转化得维生素C。这种方法用强氧化剂将L-山梨糖在4位的仲醇基氧化生成维C的重要前体——2-酮基-L古龙酸（2-Keto-L-gulonicacid，简称2-KGA）。为了保护山梨糖C6位伯醇基不被氧化，就须在酸性条件下先用丙酮处理L-山梨糖，形成双丙酮衍生物后再进行氧化；氧化后还必须水解生成2-酮基-L-古龙酸（不稳定，难分离出），再经转化而得维C。第4页，共25页，2023年，2月20日，星期二第5页，共25页，2023年，2月20日，星期二两步发酵法

以氧化葡萄糖酸杆(Glnanobacteroxydans)为主要产酸菌，以条纹假单孢杆菌（Pseudomonasstriata）为伴生菌的自然组合菌株，将L-山梨糖继续氧化成维C的前体——2-酮基-L-古龙酸，最后经化学转化制备成维C。第6页，共25页，2023年，2月20日，星期二第三节生产工艺过程莱氏法维生素C生产工艺过程1．D-山梨醇的制备山梨醇是葡萄糖在氢作还原剂，镍作催化剂的条件下，将葡萄糖醛基还原成醇羟基而制得的。第7页，共25页，2023年，2月20日，星期二

工艺过程将水加热至70~75℃，在不断搅拌下逐渐加入葡萄糖至全溶，制成50%葡萄糖水溶液，再加入活性炭于75℃，搅拌10min，滤去炭渣，然后用石灰乳液调节滤液pH8.4，备用。当氢化釜内氢气纯度≥99.3%，压强>0.04Mpa时可加入葡萄糖滤液，同时在触媒槽中添加活性镍，利用糖液冲入釜内，以碱液调节pH为8.2~8.4，然后通蒸汽并搅拌。当温度达到120~135℃时关蒸汽，并控制釜温在150~155℃，压强在3.8~4.0MPa。取样化验合格后，在0.2~0.3MPa压强下压料至沉淀缸静置沉淀，过滤除去催化剂，滤液经离子交换树脂交换，活性炭处理，即得D-山梨醇。第8页，共25页，2023年，2月20日，星期二

2．L-山梨糖的制备经过黑醋菌的生物氧化，可选择性地使D-山梨醇的2位羟基氧化成酮基，即得L-山梨糖。

第9页，共25页，2023年，2月20日，星期二工艺过程：①菌种部分将黑醋菌保存于斜面培养基中，每月传代一次，保存于0~5℃冰箱内。以后菌种从斜面培养基移入三角瓶种液培养基中，在30~33℃振荡培养48h，合并入血清瓶内，糖量在100mg/ml以上，镜检菌体正常，无杂菌，可接入生产。②发酵部分种子培养分为一、二级种子罐培养，都以质量浓度为16%~20%的D-山梨醇投料，并以玉米浆、酵母膏、泡敌、碳酸钙、复合维生素B、磷酸盐、硫酸盐等为培养基。30~340C，通入无菌空气（1VVM），并维持罐压0.03~0.05MPa进行一、二级种子培养。当一级种子罐产糖量大于50mg/ml（发酵率达40%以上），二级种子罐产糖量大于70mg/ml（发酵率在50%以上），菌体正常，即可移种。第10页，共25页，2023年，2月20日，星期二

发酵罐部分是以20%左右D-山梨醇为投料浓度，另以玉米浆、尿素为培养基，在pH5.4~5.6，灭菌消毒冷却后，按接种量为10%接入二级种子培养液。在31~34℃，通入无菌空气（0.7VVM），维持罐压0.03~0.05Mpa等条件下进行培养。当发酵率在95%以上，温度略高（31~33℃）、pH在7.2左右，糖量不再上升时即为发酵的终点。③后处理部分将发酵液过滤除去菌体，然后控制真空度在0.05MPa以上，温度在60℃以下，将滤液减压浓缩结晶即得L-山梨糖。第11页，共25页，2023年，2月20日，星期二3．2,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖（双丙酮糖）的制备

山梨糖（酮式）经过互变异构转变成环式山梨糖，再与两分子丙酮反应，将其结构中2,3-位羟基及4,6-位羟基保护起来，生成2,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖。第12页，共25页，2023年，2月20日，星期二工艺过程生产中的配料比为L-山梨糖：丙酮：发烟硫酸：氢氧化钠：苯=1:9:0.4:0.6:6（摩尔比）。将丙酮、发烟硫酸在5℃以下压至溶糖罐内，加入山梨糖，在15~20℃下溶糖6h后再降温至-8℃，保持6~7h得酮化液。然后在温度不超过25℃时酮化液中加入18%~22%氢氧化钠溶液中，调节pH至8.0~8.5。下层硫酸钠用丙酮洗涤，回收单丙酮糖；上层清液蒸馏至100℃后，减压蒸馏至约90℃为终点，再用苯提取蒸馏后的剩余溶液，然后减压蒸馏苯液得丙酮糖。第13页，共25页，2023年，2月20日，星期二4．2,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸（双丙酮古龙酸）的制备用次氯酸钠将2,3,4,6-双丙酮基-L-山梨糖氧化成2,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基古龙酸钠，再用浓盐酸酸化即得2,3,4,6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸。第14页，共25页，2023年，2月20日，星期二工艺过程①次氯酸钠的制造次氯酸钠性质不稳定，久置易分解失去氧化性，所以需新鲜配制。在35℃下将14.5%~15.5%氢氧化溶液搅拌通入液氯，以有效氯浓度9.5%~9.7%，余碱浓度2.8~3.2%为终点。②双丙酮糖的氧化配料比为双丙酮糖：次氯酸钠：硫酸镍=1：10：0.04(摩尔比)。将次氯酸钠、双丙酮糖及硫酸镍在温度40℃保温搅拌30min，然后静止片刻，抽滤。滤液冷至0~5℃时，用盐酸中和，分三段进行：pH7，pH3，pH1.5。甩滤，冷水洗，再甩滤1h，即得2，3，4，6-双丙酮基-L-2-酮基-古龙酸结晶。第15页，共25页，2023年，2月20日，星期二5．粗品Vc的制备

先将双丙酮古龙酸水解脱去保护基丙酮，再进行内酯化，最后进行烯醇化即得粗Vc。第16页，共25页，2023年，2月20日，星期二工艺过程配料比为双丙酮古龙酸（折纯）：精制盐酸（38%）：乙醇=1：0.27：0.31。生产中先将部分双丙酮古龙酸加入转化罐，搅拌加入盐酸，再加入余下的双丙酮古龙酸，盖好罐盖。等反应罐夹层满水后，打开蒸汽阀门，缓慢升温至37℃左右关蒸汽，自然升温至52~54℃，保温5~7h。反应到达高潮时，结晶析出，要严格控制温度低于60℃，高潮期过后，维持50~52℃至总保温时间20h。接着开冷却水降温1h，加入适当体积的乙醇，冷却至-2℃，放料，甩滤0.5h，再用乙醇洗涤，甩滤3~3.5h，经干燥得粗Vc。第17页，共25页，2023年，2月20日，星期二6．粗品Vc的精制

配料比为粗Vc（析纯）：蒸馏水：活性炭：乙醇=1：1.1：0.06：0.6（质量比）。将粗品Vc真空干燥（0.9MPa，45℃，20~30min），除去挥发性杂质（盐酸、丙酮），加蒸馏水搅拌，待Vc溶解后，加入活性炭，搅拌5~10min，压滤，滤液至结晶罐，加入50L乙醇，降温后加晶种使结晶。将晶体离心甩滤，再加乙醇洗涤，甩滤，将甩干品真空干燥（0.9MPa，43~45℃，1.5h）即得精制Vc。第18页，共25页，2023年，2月20日，星期二两步发酵法维生素C生产工艺1．D-山梨醇的制备（见莱氏法）2．L-山梨糖的制备（1）菌种部分黑醋菌部分同莱氏法（2）发酵液制备部分基本同莱氏法，只是D-山梨醇的投料浓度适当低些，10%左右。（3）发酵液处理部分发酵终点后对生成的L-山梨糖（醪液）应立即于80℃加热10min，杀死第一步发酵液微生物后，冷却至30℃，再开始进行第二步的混合菌株发酵。第19页，共25页，2023年，2月20日，星期二3．2-酮基-L-古龙酸的制备（1）菌种部分将保存于冷冻管的假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌菌种活化，分离及混合培养后移入三角瓶种液培养基中，在29~33℃振荡培养24h，产酸量在6~9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常无杂菌，再移入血清瓶中，即可接入生产。（2）发酵液制备部分先在一级种子培养罐内加入经过灭菌后的辅料（玉米浆、尿素及无机盐）和醪液（折纯含山梨糖1%），控制温度为29~30℃，发酵初期温度较低，通入无菌空气维持罐压为0.05MPa，pH6.7~7.0，至产酸量达合格浓度，且不再增加时，接入二级种子罐培养，条件控制同前。作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产生2-酮基-L-古龙酸，直到完全形成芽孢和出现游离芽孢时，产酸量达高峰（5mg/ml以上）为二级种子培养终点。第20页，共25页，2023年，2月20日，星期二供发酵罐用的培养基经灭菌冷却后，加入至山梨糖的发酵液内，接入第二步发酵菌种的二级种子培养液，在温度30℃，通入无菌空气下进行发酵，为保证产酸正常进行，往往定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使保持7.0左右。当温度略高（31~33℃），pH在7.2左右、二次检测酸量不再增加，残糖量0.5mg/ml以下，即为发酵终点，得含古龙酸钠的发酵液。整个发酵过程可分为产酸前期、产酸中期和产酸后期。影响发酵产率的因素主要有山梨糖初始浓度、溶氧浓度、pH值等。第21页，共25页，2023年，2月20日，星期二（3）2-酮基-L-古龙酸的分离

发酵液中除了含有一定量的2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸外，还含有大量的菌体蛋白。要将2-酮基-L-古龙酸钠从发酵液中分离提取出来，必须先除去菌体蛋白。除去菌体蛋白的发酵液中含2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸，由于2-酮基-L-古龙酸钠（能解离为阴、阳离子），用732阳离子交换树脂进行交换可去掉其中Na+而得2-酮基-L-古龙酸稀液。高温下2-酮基-L-古龙酸不稳定，所以为了浓缩古龙酸溶液使其达到一定浓度，可采用减压浓缩的方法。由于低温下2-酮基-L-古龙酸溶解度较小，所以可经冷却结晶得2-酮基-L-古龙酸晶体，从而实现了从发酵液中提取分离2-酮基-L-古龙酸的操作过程。

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2-酮基-L-古龙酸的分离工艺及操作

（1）离子交换①将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以(2～3)m3/h的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。或将发酵液加入至循环槽，经冷却调节pH值后，用泵打入微滤膜、超滤膜过滤器内除去菌体及蛋白类物质后，将滤液压入阳离子交换柱内进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出