结核病诊断实验

结核病诊断实验第1页，共39页，2023年，2月20日，星期二目录01.分枝杆菌概述02.结核病实验室检查03.小结2第2页，共39页，2023年，2月20日，星期二分枝杆菌概述013第3页，共39页，2023年，2月20日，星期二分枝杆菌属分类结核分枝杆菌(M.tuberculosis)非结核分枝杆菌（NTM）麻风分枝杆菌（M.leprae）4第4页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核分枝杆菌的发现1882年德国柯赫医生发现结核致病菌----结核杆菌5第5页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌的变迁1897年提出结核病的飞沫传播1922年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种1945年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。……6第6页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核分枝杆菌—特点(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性7第7页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病8第8页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病—临床表现症状

体征

1.全身症状：消瘦、盗汗、低热、乏力2.呼吸系统症状：咳嗽、约1/3咯血3结核变态反应表现因肺结核好发于肺上叶尖后段及下叶背段，故锁骨上下、肩胛间区叩诊音浊9第9页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病发病机制起始期细胞外增殖期和传播期共生期T细胞反应期10第10页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病发病机制结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，不留任何痕迹和感染证据。特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答起始期结核分枝杆菌在体内复制，形成感染灶，由T细胞介导的细胞免疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。特点：激活体内免疫反应（CMI和DTH），宿主获得抗结核抵抗力反应期11第11页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病发病机制在低氧、低pH、抑制性脂肪酸和宿主免疫机制共同作用下抑制细菌的增殖。结核分枝杆菌未被完全清除，细菌和宿主处于共生状态，结核杆菌主要存在于坏死组织中央。特点：可激发和维持T细胞的免疫记忆，在一定条件下再次发病共生期长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起结核病特点：结核播散增殖传播期12第12页，共39页，2023年，2月20日，星期二接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被检测

X-光/CT扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有TST（PPD）机体被感染受机体免疫力抑制没有临床症状终身处于感染状态潜伏感染有临床症状具有传染性结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的X-光或CT扫描显示异常

肺外结核难以诊断(特别是儿童)活动性结核5%5%再次激活活动性结核与潜伏感染13第13页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核病—诊断实验室检查影像检查病理检查+临床指征14第14页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌实验室检查02第15页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核诊断--临床应用几乎所有的临床内科科室都需要结核的鉴别诊断：发热待查，结核排筛结脑的鉴别诊断胸腹水患者待查儿童结核16第16页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌结核病实验室检查细菌学检查免疫学检查分子生物学检查分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学诊断细胞免疫学诊断DNA测序DNA探针技术聚合酶链反应（PCR）17第17页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核分枝杆菌-实验室检查涂片镜检细菌学检查适用于多种标本；操作简便，价格低廉。2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。肺结核治疗评估的主要依据之一

18第18页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核分枝杆菌-实验室检查缺点：不能区别是否为非结核分枝杆菌不能区别死活菌。结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。检测灵敏度较低（104-105

个细菌/毫升）。19第19页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌培养细菌学检查传统方法：L-J固体培养基快速培养法:

检测细菌生长过程中代谢产生的CO2或消耗的O2，显微镜直接观察、变色液体培养基等BACTECMGIT960系统

BACTEC460系统、、Bact/ALERT3D、ESPⅡ等。痰培养、其他标本培养20第20页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌培养阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook7H9肉汤上部空间已预先充填10%CO2BACTEC™MGIT™960/320

指示器系统21第21页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌培养1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰标本结核分枝杆菌培养

痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性用于耐多药结核疗效判定结核菌培养临床价值—确诊结核22第22页，共39页，2023年，2月20日，星期二抗酸杆菌培养优缺点敏感性较直接涂片法高，理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响，操作较直接涂片法复杂，需经严格培训。需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。成本是直接涂片法的7-8倍。23第23页，共39页，2023年，2月20日，星期二细胞免疫学检查结核菌素皮肤试验（PPD试验）γ干扰素释放试验（T-SPOT试验）24第24页，共39页，2023年，2月20日，星期二免疫学检查细胞免疫学检查PPD--结核菌素试验迟发型细胞超敏反应1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左前臂屈侧中部皮内注射，48-72h测量皮肤硬结的直径。25第25页，共39页，2023年，2月20日，星期二PPD--结核菌素试验2）判断标准：阴性≤4mm弱阳性5-9mm阳性10-19mm，强阳性≥20mm或局部出现水泡与坏死26第26页，共39页，2023年，2月20日，星期二PPD--结核菌素试验3)结核菌素试验的意义阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性：活动性结核病可能

A、变态反应尚未建立；

B、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等

27第27页，共39页，2023年，2月20日，星期二PPD--结核菌素试验

PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异性较差。当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低。

免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。

经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。PPD试验临床价值28第28页，共39页，2023年，2月20日，星期二T-SPOT实验细胞免疫学检查T-SPOT试验原理结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来。刺激抗原：ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶6）、CFP-10蛋白（培养滤液蛋白）由结核分枝杆菌特有的RD1基因编码，可刺激活化的效应T淋巴细胞产生γ干扰素。

RD1基因在BCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。29第29页，共39页，2023年，2月20日，星期二T-SPOT试验γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素30第30页，共39页，2023年，2月20日，星期二T-SPOT步骤31第31页，共39页，2023年，2月20日，星期二T-SPOT灵敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint]84.2%(32/38)Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint]98.4%(62/63)HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率

美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)32第32页，共39页，2023年，2月20日，星期二结核杆菌特异性高只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)33第33页，共39页，2023年，2月20日，星期二PPD皮试与T-SPOT试验PPD皮试T-SPOT试验估计的敏感性(活动性结核的患者）75~90%（对免疫抑制患者的敏感性进降低明显）75~95%（对免疫抑制患者的敏感性降低不明显）估计的特异性（无结核病史或暴露史的健康人）70~95%（接种BCG者的特异性进一步降低）90~100%（接种BCG者的特异性不变）与BCG的交叉反应存在存在的可能性较小与NTM的交叉反应存在存在的可能性较小与M.TB暴露的相关性存在相关性较PPD皮试大阳性结果与随访期间罹患结核的相互关系中到显著的正相关无充足的证据可重复性中等，但可变较高，但证据较少

PPD皮试和T-SPOT试验的比较34第34页，共39页，2023年，2月20日，星期二T-SPOT试验结果解释阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：①4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）减少了医生主观因素对检测结果的影响;故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊断的较为理想的手段。35第35页，共39页，2023年，2月20日，星期二非血液样本检测T-SPOT可通过一些体液成功地诊断出活动