线粒体疾病的分子生物学检验

线粒体疾病的分子生物学检验第1页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体（Mitochondrion）21.真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2.多数细胞含几个到几千个线粒体3.每个线粒体含2-10线粒体DNA（mtDNA）第2页，共104页，2023年，2月20日，星期二3线粒体功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP能量代谢第3页，共104页，2023年，2月20日，星期二其他功能

储存钙离子调节膜电位并控制细胞程序性死亡细胞增殖与细胞代谢的调控合成胆固醇及某些血红素

产热

——Wikipedia第4页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体病

Mitochondrialdisorders发现-1962年，Lufe等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年，Wallace等报道了首例由线粒体DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA突变可引起人类疾病。

定义-是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率-约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink2006第5页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体病mitochondrialdisorders——是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes80%

structuralproteinoftheOXPHOScomplexes

proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes

proteinsinvolvedinmtDNA

translation

proteinsinvolvedinmtDNA

maintenance

proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000第6页，共104页，2023年，2月20日，星期二进一步导致线粒体功能异常：①底物的运输缺陷；②底物的利用缺陷；③柠檬酸循环异常；④氧化磷酸化脱偶联；⑤呼吸链异常。第7页，共104页，2023年，2月20日，星期二发病特点

核基因突变——常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传

线粒体基因突变——母系遗传（突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。遗传异质性婴幼儿起病较常见第8页，共104页，2023年，2月20日，星期二

编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征

线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症，该女婴在出生后3天死亡。核基因突变第9页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体基因突变突变的影响：引起呼吸链功能缺陷氧化磷酸化酶异常阈值效应：组织特异性突变的mtDNA在复制分离时可能不均等分配母系遗传：不同突变后代发病风险不同。

相比A8344G突变，携带A3243G突变的母系后代更容易发病。

突变分布：同质性——各器官组织分布相同异质性——不同组织、细胞分布不同

一般特点第10页，共104页，2023年，2月20日，星期二母系遗传（MaternalInheritance）11第11页，共104页，2023年，2月20日，星期二同质性突变与异质性突变12线粒体基因同质性（Homoplasmy）0或100%异质性（Heteroplasmy）0-100%核基因纯合子（Homozygous）0或100%杂合子（Heterozygous）50%第12页，共104页，2023年，2月20日，星期二mtDNA同质性/异质性突变与阈值13第13页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体基因突变点突变目前已报道的mtDNA点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排重排突变逾数百遗传性痉挛性截瘫等

(http：//)第14页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂常染色体隐性遗传（AutosomalRecessive）常染色体显性遗传（AutosomalDominant）性连锁遗传（Sexlinked）母系遗传（Maternallyinherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemicinvolvement）影响几乎所有组织器官（Anyorganortissuecanbeaffected）

15第15页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体功能涉及众多的组织器官16第16页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体病的共同临床特点

婴儿期发病：

常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。

儿童发病：

见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。

中枢神经系统损害：

共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等

周围神经损害：

交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征

视听神经损害：

视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型听力丧失出现在KSS

肌肉病

见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinneryetal.Lancet2000第17页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病。酶测定

氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（western、比色法等）方法不稳定一般情况下，血清CK（肌酸激酶）正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失时非常高。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第18页，共104页，2023年，2月20日，星期二19线粒体疾病的生化诊断当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或破碎红纤维（RRF）为主要病理改变。（2）上述病理改变出现的频率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改变。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第19页，共104页，2023年，2月20日，星期二儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；多系统不明原因发病必须至少三个系统出现临床症状除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能排除其它代谢和非代谢疾病B肌活检在骨骼肌中存在>2%破碎样红肌纤维主要诊断标准(Bernieretal,2002)(3,5)第20页，共104页，2023年，2月20日，星期二21C有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：

50岁以下肌活检COX阴性肌纤维>2%；50岁以上肌活检COX阴性肌纤维>5%；任一组织中呼吸链酶活性<20%；任一细胞系中呼吸链酶活性<30%；多于两组织内相同呼吸链酶活性<30%；主要诊断标准第21页，共104页，2023年，2月20日，星期二次要诊断标准：A症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：①30~50岁肌活检RRF在1%~2%；②30岁以下肌活检出现RRF；③电镜下见广泛线粒体异常；B

至少一种呼吸链功能受抑制的表现：①生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%~30%；②用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；(Bernieretal,2002)(3,5)第22页，共104页，2023年，2月20日，星期二次要诊断标准：C发现可能相关的mtDNA异常；D一种或多种氧化磷酸化受损的表现：①脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高；③PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；④最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)第23页，共104页，2023年，2月20日，星期二

符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；

符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第24页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体病诊断时应注意

基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合

要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变

线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系

散发与遗传的相关性，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素第25页，共104页，2023年，2月20日，星期二第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病26第26页，共104页，2023年，2月20日，星期二27人类线粒体基因组Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

基因组小,仅16569bp

双链环状DNA

13结构基因

/mRNA22tRNA基因

2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNA基因

非编码区D-loop（约1120bp）

L链复制起始区（约30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）

高突变率线粒体基因组及其表达系统第27页，共104页，2023年，2月20日，星期二第28页，共104页，2023年，2月20日，星期二第29页，共104页，2023年，2月20日，星期二ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).第30页，共104页，2023年，2月20日，星期二CategoryGenesNADHdehydrogenase

(complexI)MT-ND1,MT-ND2,MT-ND3,MT-ND4,MT-ND4L,MT-ND5,MT-ND6CoenzymeQ-cytochromecreductase/Cytochromeb

(complexIII)MT-CYBcytochromecoxidase

(complexIV)MT-CO1,MT-CO2,MT-CO3ATPsynthaseMT-ATP6,MT-ATP8Transportchain(13peptides)Manyofthegenesencodethetransportchain:第31页，共104页，2023年，2月20日，星期二2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT-RNR1(12SrRNA)MT-RNR2(16SrRNA).第32页，共104页，2023年，2月20日，星期二22tRNAsThefollowinggenesencodetRNA:AminoAcid

3-Letter

1-Letter

MTDNA

AlanineAlaAMT-TAArginineArgRMT-TRAsparagineAsnNMT-TNAsparticacidAspDMT-TDCysteineCysCMT-TCGlutamicacidGluEMT-TEGlutamineGlnQMT-TQGlycineGlyGMT-TGHistidineHisHMT-THIsoleucineIleIMT-TILeucineLeuLMT-TL1,MT-TL2LysineLysKMT-TKMethionineMetMMT-TMPhenylalaninePheFMT-TFProlineProPMT-TPSerineSerSMT-TS1,MT-TS2ThreonineThrTMT-TTTryptophanTrpWMT-TWTyrosineTyrYMT-TYValineValVMT-TV第33页，共104页，2023年，2月20日，星期二HV2HV1340731636516024ControlregionD-loop576第34页，共104页，2023年，2月20日，星期二第35页，共104页，2023年，2月20日，星期二第36页，共104页，2023年，2月20日，星期二Replication第37页，共104页，2023年，2月20日，星期二HumanmitochondrialDNA(mtDNA)hasthreepromoters,H1,H2,andL(heavystrand1,heavystrand2,andlightstrandpromoters).TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand.TheH2promotercausesthetranscriptionofthetwomitochondrialrRNAmolecules.Transcription第38页，共104页，2023年，2月20日，星期二第39页，共104页，2023年，2月20日，星期二Theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvesthreetypesofproteins:themitochondrialRNApolymerase(POLRMT),2.mitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM),3.mitochondrialtranscriptionfactorsB1andB2(TFB1M,TFB2M).第40页，共104页，2023年，2月20日，星期二condonAnti-condonNucleartRNAMt-tRNAGCUGCCGCAGCGGGCUGCUGC第41页，共104页，2023年，2月20日，星期二第42页，共104页，2023年，2月20日，星期二第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病43第43页，共104页，2023年，2月20日，星期二核基因组与线粒体基因组的相互作用44核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制第44页，共104页，2023年，2月20日，星期二第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基因组一样，包括同义突变和错义突变缺失与插入：mtDNA拷贝数目突变：线粒体基因组变异与疾病耳聋，Leber遗传性视神经病变，糖尿病，高血压，肿瘤45第45页，共104页，2023年，2月20日，星期二46在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G(80%),T3271C（在tRNALeu(UUR)基因）MERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）：A8344G(80%),T8356C（在tRNALys基因）Leber视神经病（LHON）：G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聋（Deafness）:A1555G,T1494C（在12SrRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type2Diabetes）:A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）

NARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：T8993G,T8993C（在ATPase6基因）第46页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体病的分子诊断标本选择：

外周血白细胞——最常用毛发唾液尿液

骨骼肌——检测mtDNA分子诊断的最好标本第47页，共104页，2023年，2月20日，星期二检测已知DNA突变的方法：等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）等位基因特异性扩增（ASA）限制性片段长度多态性分析（PCR-RLFP）连接酶链反应（LCR）基因芯片技术检测未知DNA突变的方法：单链构象多态性（PCR-SSCP）变性梯度凝胶电泳（DEEG）异源双链分析（HA）DNA序列测序变性高效液相色谱（DHPLC）分子诊断方法第48页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体疾病中常见的突变核基因突变（nucleargenemutations）氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质,例如:Surf1,SCO2,NDUFV1,NDUFS1,etc.呼吸链缺陷:重复、缺失线粒体DNA点突变（mtDNApointmutations）LHON,MELAS,MERRF,NARP,etc.mtDNA缺失/重复（mtDNADeletions/duplications）

eg.KSS,Pearsonsynd,diabetes&deafness未知遗传（unknowninheritance）49第49页，共104页，2023年，2月20日，星期二第二节

线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测50第50页，共104页，2023年，2月20日，星期二“千手观音”

21位聋哑演员中18人有药物史部分患者使用正常剂量也会致聋“一针致聋”现象第51页，共104页，2023年，2月20日，星期二突变位点基

因同质性/异质性疾

病首次报道aT961delT+C(n)ins961insC12SrRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Bacinoetal.(1995)Tangetal.(2002)T1095C12SrRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Thyagarajanetal.(2000)C1494T＊12SrRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Zhaoetal.(2004)A1555G＊12SrRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Prezantetal.(1993)G1606AtRNAVal异质性综合征型耳聋Tirantietal.(1998)A3243G＊tRNALeu(UUR)异质性综合征型耳聋vandenOuweland,etal.(1992)G7444ACO1/tRNASer(UCN)同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Pandyaetal.(1999)A7445G＊CO1/tRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Reidetal.(1994)7472insC＊tRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Tirantietal.(1995)T7511C＊tRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Sueetal.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Nakamuraetal.(1995)A8344G＊tRNALys异质性综合征型耳聋Shoffneretal.(1990)G8363AtRNALys异质性综合征型耳聋Santorellietal.(1996)T14709CtRNAGlu同质性综合征型耳聋Rigolietal.(2001)G15927AtRNAThr同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Wangetal.(2008)第52页，共104页，2023年，2月20日，星期二第二节

线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术53检测位点引物序列(5′～3′)退火温度(℃)产物长度(bp)A1555GC1494TCGATCAACCTCACCACCTCT58802TGGACAACCAGCTATCACCAA7445GACGCCAAAATCCATTTCACT58987CGGGAATTGCATCTGTTTTT第53页，共104页，2023年，2月20日，星期二54对1642例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋汉族聋儿进行线粒体12SrRNA变异检测J.Luetal./Mitochondrion.2010,10(4):380–390第54页，共104页，2023年，2月20日，星期二55第55页，共104页，2023年，2月20日，星期二12SrRNA基因中有68

个核苷酸变异所有的核苷酸变异均为同质性68个核苷酸变异中，有3

个

C1494T其余

65

个变异为A1555G56第56页，共104页，2023年，2月20日，星期二57第57页，共104页，2023年，2月20日，星期二58第58页，共104页，2023年，2月20日，星期二第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变常用检测技术59第59页，共104页，2023年，2月20日，星期二Leber’sHereditaryOpticNeuropathy(LHON)第60页，共104页，2023年，2月20日，星期二Leber’sHereditary

–inheritedfrommitochondrialDNAOptic–affectstheeyeNeuropathy–disease/abnormalityofnervous system第61页，共104页，2023年，2月20日，星期二DegenerationofretinalganglioncellsandtheiraxonsInheritedfrommaternalmitochondrialDNAOccursduringyoungadulthood第62页，共104页，2023年，2月20日，星期二AcutePhase:Painless,acuteonsetofcentralvisionlossLossofvisualacuity/colouroncesymptomsappearinoneeye,othereyeaffectedweekslaterSubacutePhaseatrophyofopticdisclegallyblindAsymptomaticuntilvisualblurringdevelopsSignsandSymptoms第63页，共104页，2023年，2月20日，星期二MaternalinheritanceMutationoccursinmitochondrialDNA(mtDNA)OnlytheeggcontributesmtDNAtotheembryoGeneticsofLHON第64页，共104页，2023年，2月20日，星期二(1)G11778A:50-60%LHONpopulation(2)G3460A:8-25%LHONpopulation(3)T14484C:10%LHONpopulationSinglePointMutations

3majorpathogenicmutations:第65页，共104页，2023年，2月20日，星期二G14459AT14484C第66页，共104页，2023年，2月20日，星期二Malesvs.FemalesLHONispredominantinmalesStudieslookingatx-linkagehavenotbeenconfirmednorstatisticallysignificant第67页，共104页，2023年，2月20日，星期二Epidemiology–racedependent1177834601448470%Europeans90%Asians86%QuebecCanadiansDuetoFounderEffect

（奠基者效应）Koreans第68页，共104页，2023年，2月20日，星期二presenceofmixtureofmorethanonetypeoforganellargenomeiemtDNANumerouscelldivisionsandthuslotsoftimeisrequiredformutantallelestobeexpressedinmitochondriaSymptomsdon’tappearuntiladulthoodAlsoimplicatedasthereasonforvariabilityinseverityofvisionlossHeteroplasmy第69页，共104页，2023年，2月20日，星期二PhotoreceptorsInterneuronsRGC(retinalganglialcells)NeuronsAxonsmakeupopticnerveRetina第70页，共104页，2023年，2月20日，星期二FireactionpotentialsHugeATPdemandVerysensitivetoenergysupplyandmitochondriadefectsEspeciallyRGCsforcentralvisualfieldLimitedregeneration

abilitiesRGC:neurons第71页，共104页，2023年，2月20日，星期二Otherneuronsinthebodycanbeaffectedtoo(CNS+PNS)ThisresultsinLeber`sPlusMovementdisordersTremorsCardiacconductiondefectsMS-like（多发性硬化样）featuresAllNeuronsareVulnerable第72页，共104页，2023年，2月20日，星期二ATPDemandLeberOxidativePhosphorylatione-TransportChainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressRGC第73页，共104页，2023年，2月20日，星期二Complex1

e-prematurelyleaktoO2

aka.NADHDehydrogenaseMitochondrialMatrixIntermembraneSpace3pointmutations4e-+4H++O2

2H2Oe-+O2

O2-第74页，共104页，2023年，2月20日，星期二LessATPLeberATPDemandOxidativePhosphorylatione-transportchainROSReactiveO2SpeciesOxidativestressMoreSuperoxideO2-RGC第75页，共104页，2023年，2月20日，星期二Leber:oxidativestress+ATPdeprivationAtrophy:wearingawayoftissueChronicoxidativestress:Apoptosis(celldeath)Thingsgowrong…Thelinkisimportant!!第76页，共104页，2023年，2月20日，星期二GeneticTestingforthematernallyinheritedmitochondrialDNA.Avoidpotentialenvironmentalprecipitantssuchastobaccoandexcessivealcohol.Avoidmedicationswhichhavebeenshowntoinducethedisease(Ethambutol乙胺丁醇,Chloramphenicol氯霉素)第77页，共104页，2023年，2月20日，星期二VisiondamagefromdegenerationofopticnerveMaternallyinheritedthroughmtDNA3pointmutationsComplexIROS(reactiveoxygenspecies)TreatmentAntioxidantsInhibitmitochondrial-dependentapoptosis第78页，共104页，2023年，2月20日，星期二突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性Saillardetal.(2000)T3394CND1同质性Hofmannetal.(1997)G3460A*ND1同质性/异质性Huoponenetal.(1991)C3497TND1同质性Kongetal.(2003）G3733AND1同质性/异质性Valentinoetal.(2004)C4171AND1同质性/异质性Kimetal.(2002)T4216CND1同质性Torronietal.(1994）A4435GtRNAMet同质性Herrnstadtetal.（2002）G7444ACOⅠ同质性Huoponenetal.（1993）T10663CND同质性Brownetal.(1995)G11696AND4同质性/异质性Zhouetal.（2006）G11778A*ND4同质性/异质性Wallaceetal.(1988)T12338CND4同质性Wongetal.（2002）G14459AND6同质性/异质性Junetal.(1994)C14482G/AND6同质性/异质性Howelletal.(1998)T14484C*ND6同质性/异质性Johnsetal.(1992)A14495GND6异质性Chinneryetal.(2001)T14502CND6同质性Ozawaetal.（1991）C14568TND6同质性Wissingeretal.(1997)A14693GtRNAGlu同质性/异质性Tzenetal.（2003）A15951GtRNAThr同质性Lietal.（2006）79原发性突变：G3460A，G11778A，T14484C的突变，占全部LHON的80-90％继发性突变：T3394C，T4216C，C4019T，G5244A，C4777T，G9438A，G13708A，G15257A新突变：A4435G位于tRNAMet

基因可以调节ND4G11778A突变的外显率与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变第79页，共104页，2023年，2月20日，星期二80A4435G可以调节ND4G11778A突变的外显率tRNAMet第80页，共104页，2023年，2月20日，星期二第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技术PCR-RFLP技术PCR-SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术81G3460A，G11778A，T11484C原发性突变测序图第81页，共104页，2023年，2月20日，星期二第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于β细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的1～3％据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为2.96%线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断82第82页，共104页，2023年，2月20日，星期二第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断83第83页，共104页，2023年，2月20日，星期二线粒体DNA突变与糖尿病突变位点累及基因同质性/异质性疾病首次报道C1310T12SrRNA同质性糖尿病临床表型Guanetal.(2010)A1438G12SrRNA同质性糖尿病临床表型Vawteretal.(2009)A3243G*tRNALeu(UUR)异质性糖尿病合并耳聋Vandenetal.(1992)C3254AtRNALeu(UUR)异质性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T3264CtRNALeu(UUR)异质性糖尿病Matsuokaetal.(1997)T3271CtRNALeu(UUR)异质性糖尿病Jakschetal.(1995)G3316AMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Ogiharaetal.(1995)T3394CMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Wallaceetal.(1995)T3398CMT-ND1同质性糖尿病合并耳聋Jakschetal.(1995)A3399TMT-ND1同质性妊娠糖尿病Ngetal.(2000)T4291CtRNAIle同质性糖尿病临床表型Liftonetal.(2004)A4833GMT-ND2同质性非胰岛素依赖性糖尿病Onayaetal.(2000)A7472CtRNASer(UCN)同质性糖尿病合并耳聋Hannaetal.(2005)A8296GtRNALys同质性/异质性糖尿病合并耳聋Ohsawaetal.(1998)A10398GMT-ND3同质性2型糖尿病Katoetal.(2003)A12026GMT-ND4同质性糖尿病Onayaetal.(1998)C12258AtRNASer(AGY)异质性糖尿病合并耳聋Turnbulletal.(1998)T14709C*tRNAGlu同质性/异质性糖尿病合并耳聋Moraesetal.(1995)T16189CMT-DLOOP同质性2型糖尿病Poultonetal.(1998)84第84页，共104页，2023年，2月20日，星期二85携带tRNALeu(UUR)A3243G突变的糖尿病家系第85页，共104页，2023年，2月20日，星期二86399bp307bp92bpMUn-cut143B43B12

A3243G为异质性突变RFLPDNASequencingDHPLCControlA3243GA3242GWT第86页，共104页，2023年，2月20日，星期二87携带tRNAGly

T10003C突变的糖尿病家系

第87页，共104页，2023年，2月20日，星期二88tRNAGlyT10003C为同质性突变第88页，共104页，2023年，2月20日，星期二89AtRNAGly/tRNAstRNAThr/tRNAs第89页，共104页，2023年，2月20日，星期二90SecondarystructureoftRNAGlySecondarystructureoftRNALeu(UUR)第90页，共104页，2023年，2月20日，星期二91第91页，共104页，2023年，2月20日，星期二第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断PCR技术正向引物（F）：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′反向引物（R）：5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′扩增片段398bp（3153～3551bp）DHPLC技术PCR-RFLP技术DNA测序技术92第92页，共104页，2023年，2月20日，星期二分子诊断研究（A3243G异质性分析）收集病人外周血抽提DNAPCR扩增目的片段

PCR-RFLP测序验证RT-ARMs-qPCR（amplification

refractory

mutationsystem）Pyrosequencing（焦磷酸测序）

TargetedNext-GenerationSequencing二代测序High-throughputsequencing实例第93页，共104页，202