离心机硕士研究生演示文稿

离心机硕士研究生演示文稿现在是1页\一共有69页\编辑于星期二（优选）离心机硕士研究生现在是2页\一共有69页\编辑于星期二细胞培养EnzDNACellAbHybridoma融合瘤定点突变生物信息学蛋白组学Abzyme催化性抗体反义基因

DNA/RNA

基因转移酶学工艺诊断试剂抗体治疗基因治疗细胞融合组织培养干細胞动物克隆基因工程生物芯片人类基因组计划PCR聚合酶链放应现在是3页\一共有69页\编辑于星期二组织形态学实验方法光学显微镜技术电子显微镜技术病理尸体解剖病理与组织学标本制作病理组织学制片技术组织病理学常规染色技术组织病理学特殊染色技术免疫组织化学与酶组织化学技术现在是4页\一共有69页\编辑于星期二组织器官生化代谢分析方法通过离心、电泳和层析方法来分离提取糖、蛋白、核酸等分子及其代谢产物。通过分光光度法来测量物质含量。利用免疫学测定物质含量。利用配体－受体亲和力强的原理，来进行药理学方面的研究。采用酶学方法来分析物质。采用同位素标记、荧光标记等方法，来检测物质含量。采用质谱技术检测小分子物质含量变化。现在是5页\一共有69页\编辑于星期二四大经典的生化技术分光光度法离心法层析法电泳现在是6页\一共有69页\编辑于星期二内容提纲一、离心机的工作原理二、常用的离心方法三、离心机的分类与结构四、离心机的使用和维护现在是7页\一共有69页\编辑于星期二离心技术离心技术应用很广，在生命科学和工业生产的各个领域都有相应的使用。生物学领域：分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物。医学领域：主要用于分离、纯化细胞、病毒、蛋白质、酶和核酸。现在是8页\一共有69页\编辑于星期二相关的几个概念向心力：做圆周运动的物体所受的外力的合力。它的大小取决于外力的大小，方向是与速度的方向垂直，指向圆心。离心现象：物体远离圆心运动的现象称为离心现象，也叫离心运动。现在是9页\一共有69页\编辑于星期二现在是10页\一共有69页\编辑于星期二离心力（centrifugalforce，Fc）：它的出现是因为物体所受的外力小于做圆周运动的向心力。离心力F可以表示为：

F=mω2rω:旋转角速度(弧度／秒)r:旋转体离旋转轴的距离(cm)m:颗粒质量现在是11页\一共有69页\编辑于星期二RCF(Relativecentrifugalforce）相对离心力：就是离心力场和重力场g的比值，即离心力场相当于多少个g。沉降系数(S):是指单位离心立场下的样品的沉降速度。它与样品的质量和密度成正比。书98页表3-6-2介绍了某些生物样品的沉降系数及离心条件。rpm或者r/min:离心机转速的表示方法，一般对于低速离心机通常用这个参数。现在是12页\一共有69页\编辑于星期二离心机(centrifuge)实现离心技术的仪器。是生命科学研究的基本设备。现在是13页\一共有69页\编辑于星期二二、离心机的工作原理（一）重力场中颗粒的分离颗粒静置一段时间后，受重力场影响会开始沉降运动。粒子越重，下沉越快。反之密度比液体小的粒子就会上浮。沉降速度(sedimentationvelocity)：微粒在重力场中下降的速度。它的影响因素：微粒的大小、形态、密度、重力场的强度和液体的粘度。如红血球大小的微粒，就可以在重力环境下观察到它的沉降。如果重力场的强度（g)，则沉降速度，那么就可以实现生物大分子的分离。现在是14页\一共有69页\编辑于星期二扩散现象：重力场中扩散现象是无条件的，绝对的。特别是对于病毒和蛋白质类小分子物质，扩散对物质的沉降影响更大。如何克服？？离心机现在是15页\一共有69页\编辑于星期二

离心机即可以通过转子的高速运动产生的强大的离心力，从而加快微粒在离心力场中的沉降速度，达到分离的目的。（二）离心力场中颗粒的分离：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。现在是16页\一共有69页\编辑于星期二通常，Fc常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。“RCF”和转速可以通过下列的公式进行换算：

RCF=1.119×10－5×(rpm)2r

例如：离心机转头平均半径是6cm，当转速是用60000

r/min表示时，离心力240000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。

也可由下图得出：

现在是17页\一共有69页\编辑于星期二现在是18页\一共有69页\编辑于星期二计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFavg），即离心管中点的离心力。现在是19页\一共有69页\编辑于星期二离心机是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速10－25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25000r/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。

现在是20页\一共有69页\编辑于星期二三、常用的离心方法制备离心方法：差速离心法密度梯度离心法分析离心方法：沉降速度法沉降平衡法等密度区带分析离心法现在是21页\一共有69页\编辑于星期二原理：利用样品中各种组分的沉降系数不同(S)而进行分批分离。通常两个组分的沉降系数差在10倍以上。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，仅仅适合粗提或者样品浓缩。（一）差速离心法（differential

centrifugation）现在是22页\一共有69页\编辑于星期二其特点：介质的密度均一速度由低向高，逐级离心分辨率不高，往往适合样品的粗提对分离的细胞而言，沉降顺序依次：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。现在是23页\一共有69页\编辑于星期二LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation现在是24页\一共有69页\编辑于星期二现在是25页\一共有69页\编辑于星期二现在是26页\一共有69页\编辑于星期二（二）密度梯度离心

(isodensitycentrifugation)用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。按照离心分离原理，密度梯度离心又可分为两种类型：速率区带离心法（rate-zonal)

等密度离心法（Isopyonic）

现在是27页\一共有69页\编辑于星期二优点：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒。②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒。③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性。现在是28页\一共有69页\编辑于星期二常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。对于大多数离心来讲，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（>30%W/N）时粘性较大，但综合比较表明它可以广泛应用。当蔗糖分离一些对渗透性敏感的生物体组份时，其高渗透性就会对样品有影响，这时需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。现在是29页\一共有69页\编辑于星期二1.速率区带离心法

velocitysedimentation

用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。现在是30页\一共有69页\编辑于星期二操作注意事项1.先在离心管中装入密度梯度介质。然后将预分离样品混入一起离心。2.梯度液在离心过程中及离心完毕应该避免因为震动而引起的粒子再混合。3.离心的时间要严格控制，如果时间过长，所有样品可能全部到达离心管的底部；离心时间不足，样品则还没有完全分离。现在是31页\一共有69页\编辑于星期二用途：分离密度相近而沉降速度不等的细胞或细胞器。现在是32页\一共有69页\编辑于星期二2.等密度沉降法

isopycnicsedimentation原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。用途：分离密度不等的颗粒。现在是33页\一共有69页\编辑于星期二操作注意事项预先配置介质的密度梯度溶液，将介质和预分离样品混合或者是置于梯度溶液顶部。离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。一旦达到了平衡，再延长离心时间也不能改变粒子的成带位置。等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（CSCl），其密度可达1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。现在是34页\一共有69页\编辑于星期二Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation现在是35页\一共有69页\编辑于星期二蔗糖密度梯度溶液的制备

将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。此离心管于20-25℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5-1h。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。

小鼠肝脏线粒体蛋白的制备现在是36页\一共有69页\编辑于星期二梯度离心

（1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mL样品溶液。加样时，用注射器吸入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面。（2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0℃以25000r/min离心分离1～3h。

现在是37页\一共有69页\编辑于星期二梯度溶液的分部收集

离心后，取出离心管，置于冷室中。用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。现在是38页\一共有69页\编辑于星期二收集区带的方法有许多种：

（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。

（2）有针刺穿离心管底部滴出。

（3）

用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。

（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。

现在是39页\一共有69页\编辑于星期二离心方法的选择1.根据实验室固有的protocal进行离心条件的选择。2.根据参考文献进行离心条件的确定。3.依据离心机的型号、预离心物质的理化性质（沉降速度、密度大小等）来选择离心条件，并不断优化以达到最佳的分离效果。现在是40页\一共有69页\编辑于星期二例如：线粒体的分离现在是41页\一共有69页\编辑于星期二（三）分析离心法

分析性离心法：是为了研究生物大分子的沉降特性和结构的一种离心方法。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。现在是42页\一共有69页\编辑于星期二沉降速度法：主要用于样品纯度检查。沉降平衡法：常用的测量绝对分子量的方法。等密度区带分析离心法：主要用在核酸的分析和研究中。现在是43页\一共有69页\编辑于星期二超速离心机工作原理图解光源转轴转头样品池光学系统液面沉降界面沉降物质平衡池沉降界面峰浓度对距离的图谱现在是44页\一共有69页\编辑于星期二三、离心机的分类与结构普通离心机：最大转速6000rpm左右，容量为几十毫升至几升。转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。现在是45页\一共有69页\编辑于星期二高速离心机：最大转速为20000～25000rpm，最大容量可达3升。转头多样。一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0～40C。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。

现在是46页\一共有69页\编辑于星期二超速离心机：转速可达50000～80000rpm，相对离心力最大可达510000g，离心容量由几十毫升至两升，设有冷冻系统、真空系统和安全保护系统。分离的形式是速率区带离心和等密度区带离心。最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等。现在是47页\一共有69页\编辑于星期二离心机的结构普通离心机：电动机、离心转盘（转头）、调速器、离心套管与底座。高速、超速（冷冻）离心机：驱动电机、制冷系统、真空系统（超离有）、显示系统、自动保护系统和控制系统组成。必要的配件为离心转头和离心管。

现在是48页\一共有69页\编辑于星期二离心转头角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成。垂直转头：其离心管是垂直放置。区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似。现在是49页\一共有69页\编辑于星期二“转速”的含义

离心机的最高转速转头的最高转速转头的最高允许转速转头的允许转速现在是50页\一共有69页\编辑于星期二离心机的最高转速可以用于该离心机的转头中，转速最高的这个转速。即出厂时理想状态下的离心机状况。转头的最高转速转头盖上标明的转速即转头的最高转速，应注意，同一转头在不同离心机中使用，不一定都能达到转头的最高转速使用现在是51页\一共有69页\编辑于星期二转头的最高允许转速样品密度不超过1.2克/ml的情况下，和以下因素有关：离心机型号离心管形状、材料、厚度（注意，同样的离心管在不同转头中使用，最高允许转速也可能不同）离心管帽的材质离心管是否装满是否用适配器

必须根据实际使用情况，从转头手册和转头说明书中查询现在是52页\一共有69页\编辑于星期二离心转头的注意事项每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。现在是53页\一共有69页\编辑于星期二微机控制、触摸面板、数字显示、直流无刷电机、无碳粉污染。◆具有自动识别转子功能，防止超速使用◆具有电子门锁，提高操作安全性◆具有10种程序存储功能◆具有快速升速、快速降速功能，最快升速时间为20秒，最快降速时间为18秒。可以选择不同的升、降速时间。◆时间设定精确，以秒为单位◆自动计算RCF值◆具有点动功能（短时离心）

H-1650台式高速离心机现在是54页\一共有69页\编辑于星期二TG16-WS台式高速冷冻离心机型号ModelTG16-WS最高转速Maxspeed16000r/min1号角转子NO1anglerotor12×1.5ml(16000r/min)RCF:17800×g2号角转子NO2anglerotor10×5ml(13000r/min)RCF:11400×g3号角转子NO3anglerotor12×10ml(12000r/min)RCF:14800×g4号角转子NO4anglerotor24×1.5/2.2ml(13000r/min)RCF:15100×g5号角转子NO5swingrotor48×0.5ml(13000r/min)RCF:12810×g最大相对离心力MaxRCF17800×g定时范围Timerange0～99min电机Motor直流无刷、微机控制BrushLessDCMotor电源PowersupplyAc220V50Hz5A整机噪声Noise≤65dB(A)外形尺寸Dimension390×330×300mm(L×W×H)重量Weight25kg现在是55页\一共有69页\编辑于星期二仪器特点

■转速高达70,000rpm。

■日备有两种检测器，可供选择：

．紫外(XL-A)：190-800nm，高灵敏度

．干涉光(XL-I)：适用于没有紫外吸收之样品，如碳水化合物，高浓度样品

(<50D值)

■专利椭圆形全息衍射光栅、及四倍光束系统，减少散射光干扰。

■采用光电倍增管，大大提高检测灵敏度。

■精确可靠的控制软件及数据处理。

应用范围

■绝对／相对分子量测定

■样品纯度，浓度测定

■分子的聚和，解离分析

■热动力学和流体力学参数确定

■核酸，蛋白及病毒测定与分析

■分子间之互相作用

■配合核磁共震应用

分析超速离心机

现在是56页\一共有69页\编辑于星期二现在是57页\一共有69页\编辑于星期二四、离心机的使用和维护离心方法的选择一般是根据样品颗粒的质量和密度，选择合适的离心方法。离心机的转速和离心时间的确定：离心分离的效果除了与离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度外，实际操作时，与离心机转速、离心时间、离心介质的pH值和温度等条件有关。现在是58页\一共有69页\编辑于星期二离心事故离心机转头损坏的原因（操作或使用不当所造成的）过速腐蚀金属疲劳不平衡现在是59页\一共有69页\编辑于星期二转头的维护和存放LubricateO-ringsandrotorassemblyregularlyReplaceoverspeeddiskwhendamagedRemoverotorlid/tubeplugsandinverttherotorduringstorage现在是60页\一共有69页\编辑于星期二正确的安装转头LocktherotoronthespindleanddepressthebuttonduringinstallaitonCheckthebucketsarehookedproperlyontotherotor现在是61页\一共有69页\编辑于星期二使用前一定要先阅读手册RefertorotormanualsforoperationUselogbookstorecordhistoryofrotoruse现在是62页\一共有69页\编辑于星期二分子生物学操作注意事项克服畏惧心理。分子生物学涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与它联系起来，故它具有一定的神秘性，所以还没有进分子生物学这个门的人，都有一些畏惧心理。实际上分子生物学的基础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍(如《分子克隆》)，读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。

现在是63页\一共有69页\编辑于星期二有些已具有部分分子生物学知识的人，从各个公司的产品介绍书、专业文献中看到，很多实验的实验步骤经过前人的不断改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生轻视心理，这种心理同样也是有害的。因为基因工程实验的操作是精细而微量的，本身中间步骤多且用直观方法难以检测，实验中的每一种试剂，每一个步骤出错都可能是致命的，可导致实验完全失败，所以基因工程实验是不能完全按实验流程来计算时间的。克服轻视心理现在是64页\一共有69页\编辑于星期二在基因工程实验中，试剂的用量往往很少，液体常常可用到1微升，而普通的一滴水就有20～100微升；固体物质可用到微克甚至纳克级，这是平常肉眼看不见的。所以刚刚接触基因工程实验的人，总是担心要取的东西能否取到，准不准确，操作的样品是不是会丢失。