食品生物技术复习资料

/第一章绪论生物技术—定义为“红色生物技术"、“绿色生物技术"和“灰色生物技术”三类。“红色生物技术”是指生物制药技术，“绿色生物技术”是指农业和食品生物技术，而“灰色生物技术"是指工业、环保生物技术。食品生物技术——-现代食品生物技术的作用一食品原料和食品微生物的改良，提高食品的营养价值及加工性能;二生产各种功能食品有效成份、新型食品添加剂;三可直接应用于食品生产过程的物质转化；四工业化生产预定食品或食品功能成分。第二章基因工程4个问题：什么是基因工程——基因工程的概念在体外通过人工剪、接,将不同来源的ＤNＡ分子组成一个杂合DNA分子（ＤNＡ分子重组体),然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计，得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达.2．为什么能进行基因工程-—基因工程的原理和技术（涵盖3大理论和３大技术准备）四．基因工程3大理论，3大技术准备：（一）理论上的3大发现:1.20世纪4０年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是ＤNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Aveｒy当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2。2０世纪50年代,Wａtson-ｃｒｉck提出了DＮA结构的双螺旋结构模型,搞清楚了生物遗传物质的分子机制。３.2０世纪6０年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RＮA→Ｐr，破译了全部遗传密码，43。1。“基因剪刀”－限制性内切酶的发明２。载体（“交通工具车子"）－将质粒作为基因工程载体使用3.逆转录酶３.怎样进行基因工程-—３大步骤（ＤNＡ体外重组，重组DNA如何进行扩增和表达，基因工程后处理）４．基因工程的应用和前景（一)基因(ｇenｅ)基因——-—--从化学上来说,指的是一段DNA或RＮA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotｙpe，pｈｅnotype);从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位,一个突变单位。（二）基因工程（geｎｅticenｇinｅerｉｎg）基因工程—－-－－--－在体外通过人工剪、接,将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子（DＮA分子重组体），然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计，得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是,分子水平操作,细胞水平表达。在这个过程中：1.“基因剪刀”剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”２.“缝纫针”连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起3。“交通工具”使用载体好比一辆车子４。“乘客”有用基因（二）技术上的3大发明：1.“基因剪刀”－限制性内切酶的发明（1）20世纪40-６0年代,科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2．2＊１011（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命.（3)19７0年，Smith和Wilｃox在流感嗜血杆菌(Haｅmoｐｈilusiｎfｆuｅｎzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天,为基因工程奠定了最为重要的技术基础。2.载体（“交通工具车子")－基因工程技术诞生的第二个技术准备（1)

有了切割与缝合(ｌigａsｅ)基因ＤNA的工具，还得有一个车子—-—--将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Ｌedｅrberg就研究细菌性因子（F因子）。50-６0年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE（大肠杆菌因子)等质粒。（３）然而，直到197３年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备.3.逆转录酶－１970年Bａlｔimoｖe和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学(生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。(为什么）(1）真核基因组庞大而复杂,不易制得基因图谱.ＨＧP２005年完成,２。8万个基因,1—3kb／基因,104，2。２*1０１１（2)即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRＮA，没有成熟的mＲNA就不能得到相应得产物。（３)经过逆转录mRNA→ｃDNA（cｏmpｌeｍentoｒｙＤNA)文库要比基因组文库小得多,所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装,基因工程的临盆降生指日可待，Bｅｒg和Cohｅn两位科学的“助产士”,把基因工程接到了人间。第二节基因工程的酶学基础

常用的工具酶（toolｅｎzｙmeｓ)有：１.限制性核酸内切酶(resriｃtionｅnzyｍeｓ，resｔrictｉonｅｎdoｎaｄease）-—--定义，分类，命名１。定义一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNＡ序列。并切割dsDNA。２.分类限制酶都是从原核生物中发现的（4０0多种E/３50M）。所有的限制酶可分成3类.(1）Ⅰ、Ⅲ型,兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DＮＡ片段,与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核苷酸切割的位点一致，但罕见）。（2)Ⅱ型基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同,产生特异的DＮA片段。3．

命名(１9７3年Smｉｔh原则、Ⅱ型酶)根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶,按发现顺序排列2．DNA连接酶（DＮAligasｅ,ligaｓｅ）—功能、影响连接酶作用的因素、连接方法（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNＡ分子的粘性末端或平头末端3′－OＨ、５′－P连接作用。只能连接缺口(nick)，不能连接裂口（ｇａp).而且被连接的DＮＡ链必须是双螺旋ＤNＡ分子的一部分。(二)来源-噬菌体T4感染E．ｃoli分离的一种单链多肽酶、ＭＷ。６8KＤ。(三)催化反应：(1)需要ATＰ、Mｇ2+作辅助因子；（2）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1:１00）体外连接的几种方式:１．用ＤＮA连接酶连接具有互补粘性末端的ＤNA片断2．用Ｔ4ＤNＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；3.用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(Ａ)-poly(T）尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。4。先在ＤNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头,形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接影响连接酶作用的因素1.反应温度:连接缺口的温度：３7度连接粘性末端的最佳温度:４~15度2。T４ＤNA连接酶的用量：平末端DＮA分子的连接反应中，最适1~2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接,酶浓度0．1个单位ATP的用量1０μmｏl－１mmｏｌ／Ｌ之间3.提高外源片断与载体的浓度的比值（1０～２0倍）粘性末端ＤAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的５’而外源片断的5’－P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNＡ只有一条链与外源片断相连,失去5’-P的链不能进行连接，形成3’平末端DNA片断的连接1)。T4DNＡ连接酶２）。用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DＮＡ连接酶连接。衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linｋer）进行处理,人工加上粘性末端.衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10～20个核苷酸,其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切,便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。DNA接头(ａｄaptｅr)连接法：ﻫ它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断.粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNＡ接头分子末端,进行必要的修饰.移走粘性末端５'—P,暴露出5’—3．DNＡ聚合酶（ＤNApｏlymeraｓe，DNApｏl）–定义把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链ＤNA分子引物链的3'—OH末端,催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况.７。碱性磷酸酶(ＢAＰ或ＣIＰ)--－该酶用于脱去ＤＮA（RNＡ)5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’以1.和2。最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第三节载体载体的概念:1。要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞）,需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vｅｃtoｒ）.２.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector.3。基因工程所用的vecｔoｒ实际上是DＮA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA基因工程载体的3个特点（一）能独立自主的复制载体DＮA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制／扩增，就像载体的正常成分一样.(二）能便利的加以检测如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。(三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。噬菌体载体λ-噬菌体结构特点：1、野生型为48.5kb，两端带有12碱基的单链粘性末端，进入大肠杆菌后环化，既可溶菌又可溶原生长。２、基因组分为三个区域：左侧区包括使噬菌体成熟的全部基因；中间区不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入此区；右侧区包括所有的主要调控成分。3、λ-噬菌体基因组中只有60％是溶菌生长必需的，作为克隆载体时,可插入９~23ｋb的外源DNA片段质粒载体(１）染色体外的双链环状DNＡ分子（2)大小为1~200kb；（3）能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中可含１0～200个拷贝。（4)分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿主范围(5)质粒包含:复制起始区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点常用质粒有:pBR32２、pUC１9质粒的不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象３。柯氏质粒／粘尾质粒（cosｍid)柯氏质粒定义:含有入噬菌体粘性末端的复合质粒。由入-ＤNＡｃoｓ区与质粒重组建造而成。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。含有质粒的抗药性标记如Amｐｒ基因或Tetr基因及自主复制成分，所以这种粘性质粒可以在细菌中大量复制扩增。当体外重组的粘性质粒分子包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒的方式进行复制。②带有噬菌体的粘性末端（cos区）.这一粘性末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像噬菌体一样进行体外包装。③具有一个或多个限制酶的酶切位点。④其本身分子量小，如pＨC79仅6。5kb，可容纳40ｋb左右的DNA片段。⑤由于非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装,因而体外包装的主要是重组体,有利于以后的筛选。第四节基因工程技术与方法基因工程包括３个步骤:1．

DNA重组DＮA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNＡ重组可获得重组体DNA,是基因工程中的关键步骤2．

重组ＤNＡ导入宿主细胞-克隆扩增或表达３．

基因工程的后处理(ｄowｎ－sｔｒeaｍtｅchniquesofGE)重组DNＡ技术的基本过程：1。

载体的选择和制备-—分；2。

制备目的基因片段——切；3.

ＤNA片段的重组连接--接;4．

重组ＤNA导入受体细胞——转；5．

转化子的筛选—-筛;6．

重组子的筛选——筛；1．利用表型特征进行筛选２．物理筛选3．酶切鉴定４.核酸杂交5．PCR鉴定6．免疫学方法７.利用wｅｓterｎ杂交8利用序列测定９．转译筛选基因组文库法-定义、如何构建将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因基因文库如何构建?将某种生物体内的DＮA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNＡ片段,然后，将这些ＤNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的ＤＮA片段.也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。２。CDNＡ文库法—定义、如何构建如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫ｃDＮA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库.cDNＡ:指体外用逆转录酶催化，以mRNA为模板合成的互补ＤＮA。cＤNA：汇集某生物成熟mRNＡ为模板逆转录而成cDNA序列的的重组DＮA群体．Λ噬菌体和质粒为载体构建。在什么情况下我们选用cDNA文库法来制备目的基因?操作程序１)总RNA的提取；注意抑制ＲＮＡ酶的活性，盐酸胍,二乙基焦碳酸２)mＲNＡ的分离：选用高度分化的组织,末端带有polyＡ.３）ｃDＮA双链的合成:ｐoｌｙＡRNA为模板．４)cDNA与载体的连接5）噬菌体的包装以及转染或质粒的转化1。表型特征进行筛选a．根据载体表型特征的筛选抗药性标记插入失活法Β-半乳糖苷酶显色反应筛选法b。根据外源ＤNA提供的遗传性状的筛选ｃ.利用噬菌斑的形成d.利用遗传互补作用第六节克隆基因与表达系统一、基因工程的目的和主要工作（一）基因工程的目的有:1．生产基因工程的产品。2．改良生物的性状,对人来说是开展基因治疗.（二）根据克隆基因和宿主细胞的不同，基因工程的工作可以分成：1。克隆真核基因在真核系统表达，如开展基因治疗２。

克隆真核基因在原核系统表达，如生产基因工程的产品。３.

克隆原核基因在原核系统表达。4.

克隆原核基因在真核系统表达.由于人类赖以生存的生物类群与真核关系密切，而原核生物的繁殖优势是任何真核生物都无法比拟的,所以除了开展基因治疗外,基因工程的主要工作是克隆真核基因在原核系统表达。外源基因在原核生物中正确表达的基本条件

启动子—概念启动子—－--DNA链上一段能与RＮA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录.由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子.TATAＡT（ｐriｂｎoｗbox）为ＲＮA聚合酶结合位点，TTGＡCA是识别位点.这两个区域是决定启动子强度的重要因素。S-Ｄ序列—概念在mＲNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子ＡUＧ和一段位于AUＧ上游３~10bp处的由３～９bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16SrRNＡ3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Sｈinｅ—Dalgarno序列，简称SＤ序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响ｍRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在AＴG之后,才能产生一个完整的蛋白质。起始密码子-概念AUG（甲硫氨酸)GＵG（缬氨酸）,也就是翻译过程中,所合成多肽的第一氨基酸应是甲硫氨酸或缬氨酸终止子－概念在一个基因的末端往往有一段特定顺序,它具有转录终止的功能,这段终止信号的顺序转译后的修饰和加工－概念1.细菌ＲNAｐol不能识别真核的ｐromｏtor，故真核基因不能被该酶转录.２．从真核转录的mRNＡ缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rＲＮＡ，因此不能被翻译成蛋白．３。真核基因有内含子，而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNＡ不能形成，不能表达真核蛋白；４.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解．将真核基因克隆到1个强大的原核pｒomoｔｏr和ＳDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下，转录物由于原核SDs能与核糖体rＲNA结合,可在原核表达。这是克服1，2困难的好办法.克服3，4从真核分离出ｍRNA并逆转录成ｃＤNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内含子,这是解决第三个困难的方法，第四个困难解决的方法是采用伪装办法→将真核基因插到原核基因某密码之后，其翻译产物N端有原核多肽，这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用。第八节基因工程在食品工业应用现状一基因工程与动物\植物\微生物产品品质的改良二基因工程与植物产品储藏保鲜三基因工程与食品新资源的开发基因工程与植物产品储藏保鲜-原理PＧ基因工程ＡCＣ合成酶基因工程乙烯形成酶基因工程ＡＣC脱氨酶基因工程1。PＧ基因工程ﻫ

要点:PG基因-－－—多聚半乳糖醛缩酶是果实成熟过程中新合成的一种蛋白质．具有降解细胞间果胶质量的作用,对果实软化有很大影响．两条7５bp的长引物进行PCＲ反应，扩增出甜瓜ＰＧl基因的１28ｂp的片段,将其克隆到ｐＭD18-T载体中,筛选反向克隆,然后将其反向构建到植物表达载体pUC38—AＣC的CaＭV35S启动手和TMV增强子“Ω"的下游,构建成反义表达载体pＵC3８－ＰＧｏ用PＣR鉴定重组子。重组子PG活性降低,抗裂，抗机械损伤，不易感染。２.AＣＣ合成酶基因工程ＡＣＣ合成酶是一种以磷酸吡哆醛为辅酶的酶，在乙烯生物合成中起到关键作用。用基因工程的方法将AＣC还原酶和ACＣ氧化酶的反义基因和外源的AＣC脱氨酶基因导入正常植株中，获得乙烯缺陷型植株,达到控制果实成熟的目的，已在番茄中实现。乙烯在果实成熟中的作用：能使果实呼吸性强度大大提高，并能提高果实组织原生质对氧的渗透性，促进果实呼吸作用和有氧参与的其它生化过程使果实中酶的活动性增强并改变酶的活动方向，从而大大缩短了果实成熟的时间。而１-氨基环丙烷—羧酸(ACC）是乙烯生物合成的直接前体。３.乙烯形成酶（ACC氧化酶，ＥFE）基因工程－是乙烯生物合成途径中最后一个酶。构建EＦE的反义RNA抑制ＥFＥ的活性。4。ＡCC脱氨酶基因工程-—-ACC脱氨酶能把ＡＣC降解为α－酮基丁酸和氨,其中，α—酮基丁酸是植物体内正常代谢产物，也是乙酰乳酸合成酶的底物。AＣＣ脱氨酶基因可使任何一种植物体内的乙烯合成能力降低第三章发酵工程原理及其在食品工业中的应用第一节发酵工程概况一发酵工程的定义1.发酵的定义:借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身,或其初级代谢产物或次级代谢产物的过程2．发酵工程:利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，又称微生物工程．生物技术走向产业化的必经之路.不同碳源的利用速度不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。如：青霉素产生菌利用葡萄糖快(3０-40小时)，利用乳糖速度慢(６天)。一般情况：单糖比双糖快;双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快（淀粉最好)。快者为速效碳源,迅速参与菌体生长代谢和产生能量适于长菌慢者为迟效碳源。利于延长代谢产物的合成发酵工业中常用的原料消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率能产生最高的产品或菌体的浓度能以最大的速率产生产物副产品的得率最小价廉并具有稳定的质量来源丰富且供应充足易于通气和搅拌提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易生长因子从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质,如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的,它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型,以生物素为生长因子。提供生长因子的农副产品原料玉米浆麸皮水解液糖蜜酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉.前体物质某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。氨基酸发酵的前体物质氨基酸菌体前体物质产量/%丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸１。6色氨酸异常汉逊酵母氨茴酸0.8色氨酸麦角菌吲哚1．3蛋氨酸脱氢极毛杆菌2—羟基4－甲基硫代丁醇1.1异亮氨酸粘质赛杆菌α—氨基丁酸0.8异亮氨酸阿氏棒状杆菌D－苏氨酸１．5苏氨酸谷氨酸小球菌高丝氨酸2．0第三节培养基的灭菌灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物,一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的.在发酵工业生产中，为了保证纯种培养,在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。只有不受杂菌污染，发酵过程才能正常进行。干热灭菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据.由于微生物对于热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高,时间要长，一般160～170℃、１~1。５h.实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。火焰灭菌法利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单,灭菌彻底，但使用范围有限,仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。电磁波、射线灭菌法利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌,以紫外线最常用。紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用,但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。２50~270nm之间杀菌效率高，以波长在２６0nm左右灭菌效率最高.除紫外线外，X射线和γ射线也可进行灭菌。湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）利用饱和蒸汽进行灭菌原理:水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，高压情况下可获得高温的水蒸汽.借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键,特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力,湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说，温度升高１0℃蒸汽来源方便，价格低廉,灭菌效果可靠湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为1２1℃化学药剂灭菌法某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。湿热灭菌的原理1。微生物的热阻每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，当微生物处于最低限温度以下时,代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基本成分——蛋白质发生不可逆的变化，即凝固变性,使微生物在很短时间内死亡。湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的一般无芽胞细菌,在６０℃芽胞细菌的芽胞在10０℃某些嗜热菌能在120℃一般讲，灭菌的彻底与否以能否杀死芽胞细菌为标准。高温瞬时灭菌法原理由于灭菌时的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E’,因此，随着温度升高,灭菌速率常数增加的倍数〉培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数.即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高,超过了培养基营养成分破坏的速度。据测定，每升高10℃一般化学反应Q10为1.５~２。0；杀灭芽胞的反应Q10为5~1０；杀灭微生物细胞的反应Q10为３5左右。在热灭菌的过程中,同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。温度能加速其过程进行的速度，当温度升高时,微生物死亡的速度更快，因此可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。过滤除菌法第四节菌种的活化与扩大培养活化与扩大培养:将保存的处于休眠状态的生产菌种接入到试管斜面活化后,再经过茄子瓶或摇瓶以及种子罐逐步扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程.生产车间种子制备1。种子罐种子制备种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。１)孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子.把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。２）如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子。将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。

ﻫ种子罐级数的确定依据:菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用种子制备目的:形成一定数量和质量的菌体。发酵的目的：获得大量的发酵产物产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此,将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐内进行,既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。种子罐级数减少,有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。种龄种龄：种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间接种量定义：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例发酵罐的接种量大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。制霉菌素发酵的接种量为0.１%~1%肌苷酸发酵接种量1．5％～2％霉菌的发酵接种量一般为10%，多数抗生素发酵的接种量为7％~1５%，有时可加大到20%～25％。例如，生产制霉菌素时用1%的接种量，其效果较用１0％的为好，而0．１％接种量的生产效果与１％的生产效果相似。ﻫ种子质量标准发酵工业生产上常用的种子质量标准⑴细胞或菌体菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观.菌体形态可通过显微镜观察来确定,以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐,有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。ﻫ菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。

⑵生化指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标⑶产物生成量种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映.ﻫ⑷酶活力测定种子液中某种酶的活力,作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。ﻫ此外，种子应确保无任何杂菌污染。

种子异常的分析在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。⑴菌种生长发育缓慢或过快菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中,通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pＨ值,以判断培养基的灭菌质量。⑵菌丝结团在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团.这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下,可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多,种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团,影响发酵的正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来,也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成.

⑶菌丝粘壁菌丝粘壁是指在种子培养过程中,由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因,使菌丝逐步粘在罐壁上.其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为生产菌的种子培养过程中,发生菌丝粘壁的机会较多。ﻫ第五节发酵工艺过程控制发酵过程中的代谢变化与控制参数分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵的定义温度对发酵的影响及其控制pH值对发酵的影响及其控制溶解氧对发酵的影响及其控制菌体浓度和基质对发酵的影响及其控制补料的控制-—料分批培养(FＢC)的优点、补料的方式泡沫对发酵的影响及其控制发酵终点的判断发酵过程检测与自控应用微生物生产单细胞蛋白一、发酵法生产单细胞蛋白概念：利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、微藻、光合细菌等而获得的微生物蛋白应用:作为现代饲料工业和食品工业中重要的蛋白来源。SＣＰ营养丰富：1）蛋白质40％－８0％2)多种维生素3）碳水化合物4）脂类５)酶类和生物活性物质：辅酶A、辅酶Q、谷胱苷肽、麦角固醇6）矿物质7）氨基酸组成齐全，人体必需8种氨基酸高活性干酵母的生产活性干酵母有两个基本特征:一常温下长期贮存而不失去活性.二将活性干酵母在一定条件下复水活化后。即恢复成自然状态并具有正常酵母活性的细胞。活性干酵母生产过程

ﻫ菌种配制→发酵→分离→过滤→干燥→真空包装→贮存发酵主要原材料为糖蜜。1、高活性干面包酵母2、酒精生产、酿酒用的高活性干酵母3、制造酵母抽提物的高活性干酵母酵母抽提物即酵母精,由于其细胞内含有核糖核酸及其加工后的水解产物（腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核苷酸),其中腺嘌呤核苷酸的转化产物次黄嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸有着强力鲜味，另外,酵母细胞含有丰富的蛋白质，其水解产物中的谷氨酸等也呈鲜味，还有各种营养成分的配合,使酵母抽提物呈现出强力的鲜味。生产酵母抽提物的酵母菌种:啤酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母螺旋藻的培养生产及其应用螺旋藻的生态螺旋藻可以在土壤、沼泽、淡水、盐水、海水及温泉中生长，甚至可在一些不适宜其它生物生长的环境下生长，如在含碱量很高的湖泊中它也能良好地生长。目前，工业化生产的螺旋藻大部分利用淡水养殖，但也有利用海水养殖。螺旋藻的生产按培养规模可分为实验室培养和工业化的大规模培养；按培养基类型可分为淡水培养和海水培养；按营养类型可分为光合自养型生长培养和混合营养型生长培养。培养方法（1)封闭式池(2）封闭式光合生物反应器步骤（１)种子培养：（2）分批摇瓶培养:（3）光合自养培养：3、培养条件(1)pH:光合自养生长时,螺旋藻的最佳生长pＨ范围为8．3~１１。０，最适pH为9。0±0．5。当pH大于1１时，不利于生长。(2）温度:螺旋藻的最适生长温度为３5～37℃（3）氮源：螺旋藻除能利用无机氮外,还能利用尿素。（4）光照：当营养和温度正常的情况下,光照就成为影响螺旋藻生长的一个重要因素。发酵法生产新型食品胶—黄原胶黄单孢杆菌发酵产生的细胞外杂多糖.由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸，鼠李糖醋酸纤维素和丙酮酸等组成的阴离子杂多糖，其基本骨架为β—1,4葡萄糖连接而成直链纤维素分子，并且每隔一个葡萄糖单位都在葡萄糖的３位上连接一个三糖侧链,侧链由葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖等组成，而且甘露糖、鼠李糖分别带有乙酰基和丙酮酸基,其相对分子质量为２×106～50×１06培养基

黄单孢杆菌产生黄原胶常用的培养基是：以葡萄糖、蔗糖或淀粉等为碳源，以蛋白质、鱼粉、豆粉或硝酸盐为氮源,加KＨ２PO4、MgSO４、ＣａCO3等无机盐和Fｅ2+、Mn２+、Ｚn２+等微量元素，以及生成促进剂谷氨酸、柠檬酸等。发酵工艺黄原胶的生产包括发酵和提取两部分。发酵工艺是半连续发酵.实际过程是:种子培养种子扩大发酵。黄单孢杆菌在生长过程中吸收氧气，放出二氧化碳。其生长温度为2０-35℃,40提取工艺(1）发酵液处理。经离心法、过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化法、过滤及超滤浓缩法预处理除去菌体细胞和各种不溶性杂质,使黄原胶中不再含活性的菌体细胞、影响产品质量的不溶性杂质和色素等，并对发酵液进行浓缩。

（2）沉淀反应:用钙盐、铝盐、季铵盐或酸沉淀法制取工业级精制品;用有机溶剂沉淀法制取食品级精制品。

（３)过滤沉淀物并进行洗涤.

（4）干燥、粉碎、筛分、成品包装。１单细胞蛋白的概念,简述利用微生物生产单细胞蛋白的优点及主要的原料。概念：利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、微藻、光合细菌等而获得的微生物蛋白单细胞蛋白的特点原料来源广，微生物繁殖快,成本低,效益高。猪和牛的体重倍增时间分别为４～6周、1-2个月，植物体重倍增时间为l一2周,而细菌、酵母等微生物仅需2０~120min。1头5０0kg的母牛每天能产蛋白质约０。４kg。5００ｋg酵母每天至少生产5000kg蛋白质。在实际的工业发酵罐中，酵母能够生产出数吨蛋白质,生产率高达2—4kg／（h.m3培养液）。适合单细胞生产菌种和原料１）细胞和酵母利用甲醇、乙醇、甲烷和多链烷烃生产单细胞蛋白(SCＰ)；2)利用废物中的许多物质转化为SCＰ，如稻秸、蔗渣、柠蒙酸废料、果核、糖浆、动物粪便和污物等；３）利用藻类（如小球藻、栅藻）生产ＳCP.４）生产SＣP的微生物有酵母、非病原性细菌、放线菌和真菌及藻类等，其中饲用酵母和藻类蛋白发展最快。１．人造肉:供人们直接食用,干酵母浓缩抽出液2。食品添加剂:烘烤食品蛋白质添加物酵母浓缩蛋白:食品增鲜剂干酵母：含热量低,减肥食品的添加剂3．防止食物变质:婴儿粉、汤料、作料4．提高食品性能:与其它成分混合，食品更适于加工活性酵母:提高意大利烘饼的延薄性能5．饲料蛋白：家禽、猪、牛及鱼等动物?是否有形成肾结石及痛风的危险酵母、细菌:核酸含量较高，易引起肾结石、痛风藻类、霉类菌体:核酸含量较低，危险性小？是否会引起胃肠的不良反应乙醇培养的酵母，某些细菌、藻类：恶心、呕吐？是否会引起皮肤的不良反应亚硫酸纸浆废液培养的酵母可能会引起皮肤机能的损害?是否存有致癌的化合物致癌物，多核碳氢化合物2、简述螺旋藻的化学组成及保健作用蛋白质干藻粉蛋白质含量达50％～７0％，是大豆的2倍，比牛肉、鸡蛋白高3。５倍，更加重要的是其蛋白质中８种必需氨基酸配比合理且全面。碳水化合物螺旋藻干粉中含碳水化合物１5％～20％,其中含有７%一8％为螺旋藻活性多糖（SP－1），其相对分子质量为125９０,其组分含D－甘露糖30．938％、Ｄ－葡萄糖2９.779%、Ｄ-半乳糖22．755％、葡萄糖醛酸１6．526％,经现代医学和药理学评价，具有消除各种炎症、抑癌等功能脂肪螺旋藻具有低脂肪、低胆固醇的特点,其脂类含量仅为4%左右，其中γ—亚麻酸占1%，这种高度不饱和脂肪酸对降低胆固醇和作为前列腺素合成的前体，并对降压、止痛、消炎等具有重要的药理作用。维生素螺旋藻中含有多种维生素，其中维生素Ｂ12含量丰富,维生素E的含量也比麦芽的含量高。植物色素螺旋藻的植物色素含量丰富，其类胡萝卜素在干粉中的含量为0．2％～０。4%，为其它植物的10倍以上，主要由叶黄素和β—胡萝卜素组成。其中β—胡萝卜素在所有已知的食品中含量最高，是一类很有应用价值的色素源。它可在某些观赏动物或虾、鱼类体内合成虾青素及斑螯黄质,能有效地起到着色效果，从而使对虾、珍贵海产鱼类、观赏鱼、宠物、鸡及鸡蛋等具有美丽的色彩.矿物质ｌOOg螺旋藻干粉中含钾高达1500-2000mｇ，含镁200～3０0mg,含铁50-１00ｍg,而钠的含量甚微。钾能促进人体内钠的排泄,可预防高血压；镁具有保护人体循环器官、预防心脏病等功能;铁具有造血功能.另外，螺旋藻还含有微量元素硒、锌、锰等螺旋藻在地球上出现已有３0亿年之久,是一种利用光合作用的水生低等植物,在分类学上属于蓝藻门,颤藻科，已发现有３0多种，因其藻体呈丝状螺旋形而得名。至目前为止,有利用价值的藻种主要有两种：钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。认为螺旋藻对糖尿病、贫血症、肝脏疾病、溃疡病、胰腺炎、视力障碍、白血症、过敏症、癌症等均有治疗和预防功效3、简述黄原胶的性能及其在食品工业上的应用。(１）强亲水性:溶于冷水、热水、多种盐溶液及酸、碱水溶液中，其溶解性为热水优于冷水，碱性水优于酸性水溶液,盐浓度增加溶解性降低，溶解时间延长。（2）增稠性：黄原胶在低浓度时即可获得高粘度，在相同浓度下其水溶液的粘度是海藻胶的3~５倍。(3）稳定性:黄原胶溶液对热、酸碱、盐、水解酶等稳定。如在0－10０℃范围内加热处理其粘度基本无变化，ｐH５—（4）悬浮性与乳化性:(５)黄原胶与其他食品胶的协同增效性黄原胶与大多数合成或天然食品胶具有良好的同增效性,例如与刺槐豆胶、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素、变性淀粉、糊精、海藻胶等都能互溶，混溶后其粘度显著提高.在食品工业中的应用增稠剂悬浮剂乳化剂稳定剂．在食品工业中把它应用于奶制品，如奶酪、果奶饮料、冰淇淋、酸奶等中,可起到改善品质、增加稳定性、易于香味释放、口感细腻清爽的作用；用于果汁饮料时能保持液体均匀、不分层;加入啤酒,产泡丰富;在沙拉调汁中加入黄原胶,乳化稳定可达一年以上；点心馅中加入黄原胶,使产品不发生胶体脱水收缩现象，保持松软润口。黄原胶耐高温．用黄原胶水溶液预处理后对成品的失水起着特殊的保护作用，能达到保湿保鲜效果.ﻩ第四章细胞工程与食品工业植物细胞和组织培养技术①从健康植株的特定部位或组织,如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料,称之为外植体。②用一定的化学药剂,最常用的有次氯酸钠,升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。②外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织,由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。第二节动物细胞培养技术动物细胞和组织培养技术细胞融合技术（体细胞杂交技术）细胞培养的甚本概念传代培养（观看视频）:细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养(观看视频）从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期。原代培养作用:一个特征性的必然的生长阶段，组织细胞完成从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养:使用组织块(0。5~１立方毫米）或薄片(厚０．2毫米器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿1）原代培养期2)传代期:将原代培养物经过分割，重新接种到两个或两个以上的器皿内进行培养，进入传代培养期。整个培养过程的主要时期ﻫ特点：原代培养物－—-－-—－——要经过反复传代

注意:传代培养期并不单指原代培养物经首次传代后的“第一代”培养过程，而是指由首次传代开始经反复传代一直到培养物开始衰退之前的全部时间3)衰退期:衰退期不同于每一代培养细胞的停滞期。处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向发展。ﻫ特点:可见细胞轮廓增强，细胞质内出现暗的颗粒样结构及空泡状结构、胞质突起回缩，有时可脱落细胞系：原代培养物经首次传代成功即称为细胞系细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物连续细胞系／无限细胞系：能够连续传代的细胞有限细胞系：不能连续培养的2．２培养细胞的特性2。2。1培养细胞的生长方式1）贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长.见于各种实体瘤细胞2）悬浮生长:于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞

培养细胞生长的条件1）细胞的营养需要：能源物质、碳源、氮源、水分、无机盐和生长因子等2）细胞的生存环境温度：３7O2CO２：５％CO2+H2Ｏ←→H2CO3←→H++ＨＣO3-pH：７.2-７。4渗透压3）无污染4)无毒为什么要控制渗透压？渗透压通过什么办法来调整？——维持细胞的正常形态和功能；控制培养液的物质浓度培养细胞活力测定任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1)细胞克隆形成率实验ﻫ单个细胞在体外增殖６代以上,其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力克隆形成率比＝克隆形成数/接种细胞数缺点:操作繁琐优点：精确、可靠无菌操作中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射３0-６0分钟灭菌，以70%etｈanol擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟操作时,小心取用无菌之实验物品，避免造成污染.勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。ﻫ１)游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间:10分钟一４小时2）贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在１0分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等细胞如何实现贴壁生长血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质)，这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的底物附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）３）潜伏期此时细胞有生长活动,而无细胞分裂.细胞株潜伏期一般为6~24小时4）对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。5)停止期（平台期）:细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂为什么有活力但却不再分裂？机制：接触抑制、密度依赖性接触抑制、密度依赖性定义:细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象。将正常细胞因相互接触而抑制分裂的现象改称为密度依赖性的生长抑制。为什么恶性细胞能无限增生:在相同条件下培养的恶性细胞对密度依赖性生长抑制失去敏感性，因而不会在形成单层时停止生长,而是相互堆积形成多层生长的聚集体,这种现象也说明恶性细胞的生长和分裂已经失去了控制，调节细胞正常生长和分裂的信号对于恶性细胞不再起作用。ﻫ为什么——--——细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被。作用：在细胞上起识别作用.当细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，思考:为什么对动物细胞培养时通常要添加血清?——在人们没有完全清楚细胞所需营养物质的条件下，通过向成分已知的合成培养基中添加血清模拟内环境,能保证细胞得到生长增殖所必须的各类物质因子。贴壁生长细胞传代方法:ﻫ1.吸光培养瓶中的培养液2．加入1-２ml0．25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2－10miｎ（显微镜下动态监测）.3．吸去胰蛋白酶液，加入培养液.４.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液。5.吸取１/10-1／４0细胞悬液,接种于新的培养瓶内.6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内.7。将后者放入培养箱中培养.培养细胞活力测定ﻫ细胞生长各个时期的特点:ﻫ

滞后期(延迟期）：细胞很少分裂,其长短与接种量、ﻫ大小和继代时原种细胞所处的生长期有关;

对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速

率保持不变；ﻫ直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期ﻫ缓慢期：生长逐渐缓慢，培养液消耗将尽,有毒代谢ﻫ物质增多,氧气减少;

静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极

少，甚至开始死亡。细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

一悬浮培养(cellsusｐensionculture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。愈伤组织诱导愈伤组织源出于自然生长的植物受损伤时，在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，瘤状突起内的细胞相对于植物体成熟细胞已发生脱分化的变化。这一概念后来被引入植物组织培养领域.培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的组织，这种组织具有再分化的能力。要求:松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色,呈细小颗粒状,松散易碎。如何获得符合要求的愈伤组织?1、选择适宜的外植体:胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。不同外植体的比较：一般双子叶植物比单子叶和裸子植物诱导愈伤组织容易;幼年细胞和组织比成年细胞和组织容易;二倍体细胞比单倍体细胞容易。2、选择适宜的培养基:生长素浓度很重要，配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物.外源激素是一种诱导剂,能诱导细胞开始分裂，外源生长物质往往是通过调整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的。最常用的有2，4－D、NAA、IＡＡ和细胞分裂素等。组织的机械损伤也作为一种刺激因素诱导细胞开始分裂，愈伤组织往往出现在伤口处。有些天然提取物对愈伤组织的诱导和维持十分有益,常用的有椰子汁（10%)，0．５%的酵母提取物，5%～10％的番茄汁。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养.成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在３0～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。２、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色.３、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2~3天甚至更短时间便可增加１倍。基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时,细胞及停止生长.在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成Ｓ形曲线。②悬浮培养细胞数目的增殖变化细胞生长各个时期的特点：

ﻫ滞后期（延迟期）：细胞很少分裂，其长短与接种量、

大小和继代时原种细胞所处的生长期有关；

对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加,增长速

率保持不变；ﻫ直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期

缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢

物质增多,氧气减少；

静止期：生长几乎处于停止状态,细胞数目增加极ﻫ少，甚至开始死亡。培养周期的概念具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程,称为一个培养周期.培养细胞的起始密度最低有效密度的概念

在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。

最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为-—10４——105细胞/ml。细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化,所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态.工作中常用的处理方法:

①物理方法

A、分选法ﻫ通过细胞体积大小分级,直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。B、冷处理法。ﻫ低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度。

②化学方法ﻫA、饥饿法ﻫ悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G１或G2期,经过一段时间的饥饿之后,当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。B、抑制剂法ﻫ通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期,当解除抑制后,即可获得处于同一细胞周期的细胞。

常用的抑制剂有5—氟脱氧尿苷，5—氨基尿嘧啶、羟基尿等。

C、有丝分裂阻抑

用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物,浓度一般控制在0.2％，处理时间以４-６小时为宜。

悬浮细胞的同步化无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡,因此在进行同步化处理之前,细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期二、单细胞培养悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析,也就不能进行定点选择。因此,在进行细胞株(种子细胞)选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下,必须进行真正意义上的单细胞培养.由于植物细胞的团聚性,单细胞培养还比较困难。、细胞平板培养平板培养(platecｕltｕre):将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。1）单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。２)单细胞悬浮液的制备:分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5×105／ｍl。3）植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中,厚度约1～2ｍｍ。4)封口:用石蜡膜封培养皿。镜检：用倒置显微镜观察将单细胞做标记,已获得真正的单细胞系。培养：２5℃平板培养的效果一般用植板率来衡量.植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例.植板率(％）＝每个平板形成的细胞团数每个平板接种的细胞总数平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键,而细胞密度和培养基成分互相依赖（负相关）。２、看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。操作方法:在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织,再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后,将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长三、植物细胞的规模化培养及有用物质生产第四节细胞融合技术细胞融合定义,利用自然或人工方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞．机理1）细胞膜的结构磷脂双分子层，因此具有流动性2)如何实现不同细胞之间的融合:１.膜之间相互靠近(克服二者之间静电斥力和水合力）2．两层膜连接起来（局部双层结构破坏，形成不稳定的中间结构）3．胞内物质交换（遗传物质发生交换重组）4．新的双层构象重新形成3)主要影响因素(1)pＨ；〉8—9形成双层,＜7形成非双层（2）钙离子：诱发膜上带负电荷脂双层结构不稳定，并能中和电荷，静电斥力减弱,水化作用减弱。(3）温度：温度升高，使非双层脂的脂双层