酶组织化学应用课件

酶组织化学---水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法组织化学狭义应用化学和物理学原理在组织切片上，加入某种试剂使其与组织切片中欲检测的物质发生反应，最终形成有色沉淀，在显微镜下观察，以研究组织细胞结构与功能之间的关系。1.基本原理细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在偶氮偶联法⑴Gomori萘酚磷酸酯法---AKP在碱性条件下将α-萘基磷酸钠水解出α-萘酚,随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联,形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】α-萘基磷酸钠,蒸馏水,5%四硼酸钠,10%硫酸镁,固蓝B盐⑵六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红。（偶联人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素）【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红

【操作步骤】1.小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片2.甲醛钙液(Fca)固定5分钟,4℃,然后蒸馏水洗,也可不固定3.作用液5~60分钟,37℃或室温4.蒸馏水洗5.4%甲醛固定15分钟~2小时,室温6.自来水洗,蒸馏水洗7.1%甲基绿(氯仿洗过)5~10分钟,蒸馏水洗8.甘油明胶封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶

3.水解酶

4.裂合酶

5.异构酶

6.合成酶水解酶---一类增加或去除水，催化水解反应的酶

AB+H2OAH+BOH显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙磷酸钴硫化钴【孵育液】2%巴比妥钠,3%β-甘油磷酸钠,2%无水氯化钙,5%硫酸镁AKP

【操作步骤】

1.新鲜组织低温冰冻切片2.不固定切片直接进作用液,或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟~2小时,4℃,蒸馏水洗3.作用液10~60分钟,37℃4.蒸馏水洗5.2%硝酸钴1分钟6.蒸馏水洗7.1~2%硫化铵1分钟8.蒸馏水洗9.甘油明胶封片,或脱水,透明,中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀肾曲管碱性磷酸酶---钙钴法X200(二)酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP)

在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解最适PH为4.8~5.2

抑制剂因组织差异而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛分布:主要位于溶酶体内应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++)

Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+++)

尤文氏瘤,成骨肉瘤等(-)显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠磷酸酯+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色2.同时偶联法【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮对品红ACP涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶X400(三)5′核苷酸酶(5′nucleotidase)

催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5′位置水解磷酸酯的水解酶最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5,睾丸、脑、肝分别为8.5、7.5~8.5、8.0

激活剂：Mg++，Mn

++

抑制剂：氟化钠（0.1MNaF），硼酸钠OHOHHOHOHHOHH碱基(嘌呤、嘧啶）（H）+H2O

Pi5′NaseHO-CH2OHHOHHOH（H）H碱基CH2OPHO5′核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶5′核苷酸酶的显示----铅法【基本原理】5′Nase水解底物5′单磷酸腺苷AMP磷酸+铅磷酸铅硫化铅（黑色）【注意】5′核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似

5′NaseAKP1.肾组织中分布肾小管刷状缘(+),所有仅肾小管刷状缘(+)

基膜也(+)2.β-甘油磷酸钠(—)(+)5′Nase作为底物(五)腺苷三磷酸酶又称ATP酶ATPADP+Pi+能量根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类ATP酶1.肌球蛋白腺苷三磷酸酶定位于骨骼肌最适PH为9.0~9.4被Ca++激活,而被Mg++抑制常用作区分二型肌纤维:Ⅰ型(红肌)----收缩慢,活动持久,其酶活性高,染色深

Ⅱ型(白肌)----收缩快,活动不持久,其酶活性低,染色淡ATPase2.膜性腺苷三磷酸酶

又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶最适PH7.2~7.5

激活剂:Mg++,Na+,K+

抑制剂:Ca++,苦毒毛旋花子甙常存在于细胞膜,特别是分泌功能活跃的细胞膜。3.线粒体腺苷三磷酸酶

心肌最丰富，肝脏次之心肌的线粒体ATP酶被Mg++激活，而被Ca++抑制肝细胞线粒体ATP酶可同时被Mg++、Ca++激活心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对-氯汞苯甲酸（PCMB）抑制种类定位最适PH激活剂抑制剂肌球蛋白ATP酶膜性ATP酶线粒体ATP酶（六）非特异性酯酶酯酶可分为三类——非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶非特异性酯酶---水解短链脂肪酸的酯脂酶---水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶---水解胆碱的酯酶非特异性酯酶—

最适PH5.0~8.0

定位在溶酶体和内质网,在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性

应用----单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反应

1.在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值

2.可作为T、B淋巴细胞的鉴别显示非特异性酯酶法---同时偶联法

用乙酸-α-萘酯或萘酚AS衍生物为底物，在酶作用下，释出α-萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料（一）脱氢酶

脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体

组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种1.瑚珀酸脱氢酶（SDH）

SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。不需辅酶的存在

SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合最适PH7.【显示方法】Pearson二甲亚砜法【基本原理】琥珀酸盐+受氢体（四唑盐）富马酸+还原的受氢体

（无色）（蓝色沉淀）【作用液】0.1M琥珀酸钠,0.1M磷酸盐缓冲液PH7.6NBT(硝基蓝四唑),二甲亚砜(DMSO)【步骤】

1.新鲜组织低温冰冻切片2.作用液15~35分钟3.生理盐水洗4.Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟5.入80%乙醇5分钟6.甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶X4002.乳酸脱氢酶（LDH）

需辅酶的脱氢酶广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系最适PH7.4

肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应

乳酸盐+NAD丙酮酸盐+（NADH+H+）

LDH（辅酶Ⅰ）（还原型辅酶Ⅰ）（二）过氧化物酶

催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其