第三节基因重组和杂交育种

第三节基因重组和杂交育种第1页，共35页，2023年，2月20日，星期一

杂交：

两个性状不同的菌株之间进行细胞结合，遗传物质交换，重新组合成新的遗传型个体的方式。

基因重组：两个独立基因内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。第2页，共35页，2023年，2月20日，星期一重组和杂交的关系（1）基因重组是在核酸分子水平上的一个概念，是遗传物质在分子水平上的杂交。而杂交是在细胞水平上进行的，但其中包含了核酸分子水平上的重组。（2）基因重组是杂交育种的理论基础。（3）真核生物中的有性杂交、准性杂交、原生质体融合以及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等。第3页，共35页，2023年，2月20日，星期一微生物中各种基因重组形式的比较整体染色体局部杂交高频率低频率部分染色体个别或少数基因细胞融合或联结性细胞真菌的游行生殖体细胞真菌的准性生殖细胞间暂时沟通细菌的接合性导细胞间不接触吸收游离DNA片段转化噬菌体携带DNA转导由噬菌体提供遗传物质完整噬菌体溶源转变噬菌体DNA转染重组范围供体和受供体间的关系第4页，共35页，2023年，2月20日，星期一一二四三转化转导接合原生质体融合形式一、原核生物的基因重组第5页，共35页，2023年，2月20日，星期一（一）转化（transformation）定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段并把它整合到自己的基因组中，而获得供体菌部分遗传性状的现象，称为转化（或者转化作用）。

1、概述:转化的特点：不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。

转化子通过转化方式而形成的杂种后代第6页，共35页，2023年，2月20日，星期一2、感受态定义：指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。研究发现，凡能发生转化，其受体细胞必须处于感受态—从时间上来看，有的出现在生长的指数期后期—在具有感受态的微生物中，感受态细胞所占比例和维持时间也不同—外界环境因子也有重要影响（一）转化（transformation）第7页，共35页，2023年，2月20日，星期一（一）转化（transformation）

转化因子的本质是离体的DNA片段。一般原核生物的核基因组是一条环状DNA长链，不管在自然条件或认为条件下都极易断裂成碎片，故转化因子通常都只是15kb作用的片段。转化的频率通常为0.1%~1.0%,最高为20%。3、转化因子4、转化过程转化过程被研究得较深入的是G+S.pneumoniae

第8页，共35页，2023年，2月20日，星期一G+细菌的转化过程及其机制示意图第9页，共35页，2023年，2月20日，星期一（一）转化（transformation）5、转染

指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或其原生质体，可增至出一群正常病毒后代的现象。

从表面上看，转染与转化相似，但实质上两者的区别十分明显。因为作为转染的病毒核酸，绝不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也绝不是能形成转化子的受菌体。第10页，共35页，2023年，2月20日，星期一转导的种类

通过缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。

(二)转导（transduction）

普遍转导局限转导由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子完全普遍转导流产普遍转导低频转导高频转导第11页，共35页，2023年，2月20日，星期一

(二)转导（transduction）

1、普遍转导通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。（1）完全普遍转导（普遍转导or完全转导）以S.typhimurium为例

用野生型菌株作供体菌

营养缺乏型突变株作受体菌

P22噬菌体作转导介质第12页，共35页，2023年，2月20日，星期一由P22噬菌体引起的完全普遍转导过程示意（1）当P22在供体菌内增值时，宿主的核染色体组发生断裂，待噬菌体成熟与进行包装之际，有10-6~10-8个噬菌体的衣壳与噬菌体头部DNA核心大小相仿的一小段供体菌DNA（P22约可包装核染色体组的1%）误包，形成了一个完全不含P22自身DNA的完全缺陷噬菌体，此即转导颗粒。（2）当供体菌裂解时，若把少量裂解物与大量的受体菌接触，务必使其感染复数小于1，这一完全缺陷噬菌体就可把外源DNA片段导入受体细胞内。第13页，共35页，2023年，2月20日，星期一由p22噬菌体引起的完全普遍转导第14页，共35页，2023年，2月20日，星期一（3）导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而整合到染色体组上，从而使后者成为一个遗传性状稳定的重组体，称做普遍转导子。外源dsDNA片段经双交换形成一稳定转导子示意图第15页，共35页，2023年，2月20日，星期一（2）流产普遍性转导（abortivetransduction）能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释。

第16页，共35页，2023年，2月20日，星期一定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。特点：只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率（约10–

5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶原菌的诱导并引起裂解后才产生。分类：低频转导与高频转导2.局限转导(specializedtransduction)第17页，共35页，2023年，2月20日，星期一一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（10–4~10–6）。把这种裂解物称为低频转导裂解物。通过一般溶源释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数（10–4~10–6）转导子，故称低频转导（1）低频转导（LFT，lowfrequencytransduction）第18页，共35页，2023年，2月20日，星期一当用LFT裂解物以高m.o.i感染E.coligal–（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有λdgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的λ噬菌体。这时λ与λdgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌（doublelysogen）。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常λ噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helperphage）。双重溶源菌的裂解物中含有等量的λ和λdgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。（2）高频转导（HFT，highfrequencytransduction）第19页，共35页，2023年，2月20日，星期一3.溶源转变概念：当正常的温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。原因：这是一种不携带任何外源基因的正常噬菌体是噬菌体的基因而不是供体菌的基因提供了宿主的新性状新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失第20页，共35页，2023年，2月20日，星期一定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因片段传递给后者，使后者获得若干心遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）（二）接合（conjugation）

J.Lederberg等采用E.L.Tautum（1946）建立用E、coli的两株营养缺陷型突变株在基本培养基上是否生长来检验重组子存在的方法后，奠定了方法学上的基础；第21页，共35页，2023年，2月20日，星期一研究细菌接合方法的基本原理

此法也是目前微生物遗传学和分子遗传学中最基本的核极为重要的研究方法之一。第22页，共35页，2023年，2月20日，星期一存在范围：细菌：G–较为多见如E.coli、Salmonella、Shigella、Klebsiella（克雷伯氏菌属）、Serratia（沙雷氏菌属）、Vibrio（弧菌属）、Azotobacter（固氮菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）等放线菌：Streptomyces（链霉菌属）、Nocardia（诺卡氏菌属）接合还可发生在不同属的菌种之间，如E.coli与Salmonellatyphimurium之间或S.typhimurium与Shigelladysenteriae（痢疾至贺氏菌）间E.coli的F因子：决定性别的质粒，属于附加体（episome），可以通过接合作用获得，也可以通过吖啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素等的处理而消除。第23页，共35页，2023年，2月20日，星期一根据F质粒在细胞内的存在方式，可将E.coli分为四种类型：

①F+（“雄性”）菌株：

细胞内含有（1~4个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F–相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F–细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。第24页，共35页，2023年，2月20日，星期一

细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。可以通过与F+、F’或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F’因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F’菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E.coli中约有30%是F–菌株。②F–（“雌性”）菌株：第25页，共35页，2023年，2月20日，星期一③Hfr（高频重组，highfrequencyrecombination）菌株：含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F–

接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。Hfr菌株与F–菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5’端开始等速进入F–细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。第26页，共35页，2023年，2月20日，星期一细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F–

菌株接合，使其成为F′菌株。F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F因子也缺失一段DNA.由Hfr异常释放所生成的F’菌株，称为初生F’菌株；由F–接受外来F′因子所产生的F′叫作次生F′细胞；④F’菌株：第27页，共35页，2023年，2月20日，星期一

F因子转导F-mediatedtransduction:

利用F’菌株与F–接合可将供体染色体DNA传入F–菌株，从而使F–既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得F因子。这种接合方式叫做F因子转导,又称性导sexduction.初生F’菌株和次生F’菌株的由来第28页，共35页，2023年，2月20日，星期一(四)原生质体融合

原生质体融合

通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得具有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。所获得的重组子叫融合子。原生质体融合的操作示意图第29页，共35页，2023年，2月20日，星期一二、真核微生物的基因重组主要方式：有性杂交准性杂交第30页，共35页，2023年，2月20日，星期一（一）有性杂交

一般指不同遗传型的两性细胞间的接合和随之发生通过减数分裂，并产生高频率基因重组并产生新遗传型后代的过程。凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原