柠檬酸发酵的学习教案

柠檬酸发酵的学习教案第1页/共107页柠檬酸1784年由Scheels氏发现1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸1893年德国微生物学家Wehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬酸1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的浅盘法柠檬酸发酵，并在比利时设厂生产。1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料，经水解后深层发酵大规模生产柠檬酸。

柠檬酸第2页/共106页第2页/共107页

柠檬酸我国1953年采用浅盘法发酵生产柠檬酸，1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。第3页/共106页第3页/共107页我国柠檬酸行业：产量位居世界第一；从技术上，处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势在于：1.发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。2.采用边糖化边发酵工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外要短。3.柠檬酸的产酸速度大大高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍。第4页/共106页第4页/共107页柠檬酸的消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％第5页/共106页第5页/共107页我国有机酸行业发展的思考（2011年8月）我国柠檬酸年产能已经达到百万吨，占世界的70％左右；年产量达70余万吨，约占世界的65％；年出口量50万吨，超过世界贸易总量的一半。我国是世界上最大的柠檬酸出口国，主要出口到印度、美国、欧洲、日本等地。

但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨第6页/共106页第6页/共107页我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研究，1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。1965年，上海市工业微生物研究所筛选出N558菌种，并与天津工业微生物研究所，南通发酵厂等合作，使之用于工业化生产，并在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层发酵法生产柠檬酸。第7页/共106页第7页/共107页我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望从七十年代到九十年代，我国一直致力于柠檬酸生产菌种的改进，1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20％，上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原料，以黑曲霉为菌种，固体发酵法生产柠檬酸钙的研究。并于1977年中试成功并投入生产，现在全国已有四十余个工厂，采用固体发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。第8页/共106页第8页/共107页我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年，先后在天津、上海、沈阳等地进行研究，并一度投入小规模试验生产，是用正烷烃为原料，以解脂假丝酵母为菌种，发酵产酸达13％以上，转化率140％以上，但因柠檬酸只占总酸的50%（另一半为异柠檬酸）而且由于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等原因，未能坚持研究和生产。第9页/共106页第9页/共107页我国的发酵技木及生产水平，特别是菌种及发酵工艺均为世界领先水平。薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深层发酵技术为我国所独有。国外发酵罐容积通常在200m3，并较早实现自动控制；我国的最大柠檬酸发酵罐为150m3第10页/共106页第10页/共107页一、

柠檬酸在食品中的应用

1)

饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。第11页/共106页第11页/共107页2)

果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。第12页/共106页第12页/共107页3)

腌制品

各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。4)

罐头食品

加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。第13页/共106页第13页/共107页5)

豆制品及调味品

用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。6)

其它

柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。第14页/共106页第14页/共107页二、

柠檬酸发酵微生物

1)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的形态特征

目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。第15页/共106页第15页/共107页二、

柠檬酸发酵微生物

2)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的生理特征

黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。生长最适pH因菌种而异，一般为pH3~7；产酸最适pH为1.8~2.5。生长最适温度为33~37℃，产酸最适温度在28~37℃，温度过高易形成杂酸；斜面培养：麦芽汁4°Be′的培养基。第16页/共106页第16页/共107页二、

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。第17页/共106页第17页/共107页二、

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。

第18页/共106页第18页/共107页三、柠檬酸发酵机理关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。第19页/共106页第19页/共107页柠檬酸的溢出代谢：

多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。

柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。

引起溢出代谢的原因包括以下三个方面：第20页/共106页第20页/共107页①高水平的柠檬酸合成能力。

这个能力由3个因素构成。

第一：是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对AcCoA具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；

第二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；第21页/共106页第21页/共107页第三：是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。

此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。第22页/共106页第22页/共107页②较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一：是低水平的α-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二：在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸）更明显。第23页/共106页第23页/共107页③在柠檬酸过量合成阶段，培养基的pH值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；

柠檬酸的分泌也会影响培养基的pH值。

锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。第24页/共106页第24页/共107页黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出GG-6-P(磷酸果糖激酶)柠檬酸,NH4I+A1.6－二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸乙酰CoA柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸(丙酮酸羧化酶)(柠檬酸合成酶

)α-酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶第25页/共106页第25页/共107页TCA循环在柠檬酸积累中的调节1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。第26页/共106页第26页/共107页回补途径☆TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；☆生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；☆回补方式：①通过某些化合物的CO2固定作用，②一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和-酮戊二酸，③通过乙醛酸循环第27页/共106页第27页/共107页★通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：丙酮酸羧化酶：

CO2+丙酮酸+ATP+H2OMg++

草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:

CO2+PEP+H2O草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶:CO2+丙酮酸+NADPH+H+苹果酸+NADP+为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。①

CO2固定作用补充TCA环的中间产物第28页/共106页第28页/共107页第29页/共106页第29页/共107页②转氨基作用定义：

α-氨基酸的氨基通过酶的催化，转移到α-酮酸

的酮基上，生成相应的氨基酸；原来的α-氨基酸则转变成相应的α-酮酸。R1CHNH2+COOHR2C=OCOOHR1C=O+COOHR2CHNH2COOH

转氨酶第30页/共106页第30页/共107页转氨基作用几点说明：（1）可逆反应，（2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的转氨酶：

丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（GPT）天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶(GOT)

ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、AST用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）第31页/共106页第31页/共107页CH3

H-C-NH2+

COOHCOOH

（CH2）2

C=O

COOH

丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT

活性显著增高。ALTCH3

C=O

+

COOHCOOH

（CH2）2

H-C-NH2

COOH第32页/共106页第32页/共107页COOH

CH2+H-C-NH2

COOHCOOH（CH2）2

C=O

COOHAST

天冬氨酸α-酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.COOH

CH2+C=O

COOHCOOH（CH2）2

H-C-NH2

COOH第33页/共106页第33页/共107页③乙醛酸循环草酰乙酸柠檬酸琥珀酸异柠檬酸苹果酸延胡索酸乙醛酸乙酰CoA乙酰CoA乙酸乙酸第34页/共106页第34页/共107页乙醛酸循环能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+乙酸苹果酸琥珀酸+乙酸→→→异柠檬酸净反应：2乙酸苹果酸第35页/共106页第35页/共107页柠檬酸发酵机理大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强。葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。第36页/共106页第36页/共107页葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反应+草酰乙酸顺乌头酸酶柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶琥珀酸α—KGA（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶

的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。第37页/共106页第37页/共107页柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制——追求柠檬酸的高产率柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？

第38页/共106页第38页/共107页1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节从葡萄糖→→柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，……研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+

浓度是如何升高的呢？

在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。第39页/共106页第39页/共107页1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+

缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。第40页/共106页第40页/共107页Mn+

缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？当培养基中Mn+

缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：氨基酸合成蛋白质分解氨基酸氨基化合成氨基酸第41页/共106页第41页/共107页2.顺乌头酸酶活性的控制该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+

的影响，控制培养基中的Fe2+

的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度又要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。第42页/共106页第42页/共107页顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。第43页/共106页第43页/共107页那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：……，是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？

提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？第44页/共106页第44页/共107页菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响第45页/共106页第45页/共107页如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。第46页/共106页第46页/共107页柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。第47页/共106页第47页/共107页解偶联剂（uncoupler）?使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+梯度，因而无ATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncouplingproteins，UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：质子载体：2，4-二硝基酚(DNP，图)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。质子通道：增温素（thermogenin）。其它离子载体：如缬氨霉素。某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。第48页/共106页第48页/共107页实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。第49页/共106页第49页/共107页

理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。科学研究过程中的许多基本规律是相同的，今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识……首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设……第50页/共106页第50页/共107页CO2固定反应通过CO2固定反应提供C4二羧酸（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。第51页/共106页第51页/共107页柠檬酸发酵中，三个控制点C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A+C4二羧酸

柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+

的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点第52页/共106页第52页/共107页第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）Δ

柠檬酸和ATP对该酶有抑制生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量ΔMn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制第53页/共106页第53页/共107页第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：

许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸第54页/共106页第54页/共107页柠檬酸生物合成途径

第55页/共106页第55页/共107页柠檬酸的积累机制总结1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。第56页/共106页第56页/共107页柠檬酸的积累机制总结3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7；4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。第57页/共106页第57页/共107页柠檬酸积累的理想条件：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高柠檬酸合成酶的活性4、抑制顺乌头酸酶的活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性第58页/共106页第58页/共107页柠檬酸发酵需要下述环境条件(1)磷酸盐浓度低；(2)氮源用NH4+盐；(3)pH值低（<3.0）；(4)溶氧量高；(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。第59页/共106页第59页/共107页柠檬酸发酵的产率1.无CO2固定反应的产率

192/(180×1.5)==71.1%2.通过CO2固定反应提供C4二羧酸（无碳原子损失）

192/180==106.6%C6H12O6C6H8O7(C没有增加)

可见，CO2固定反应与柠檬酸发酵的重要性

C6H8O7H2O理论转化率：116.7%第60页/共106页第60页/共107页柠檬酸发酵实验第61页/共106页第61页/共107页柠檬酸发酵一、菌种：产生柠檬酸的菌种很多，以霉菌为主，又以黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。二、发酵机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。第62页/共106页第62页/共107页柠檬酸发酵三、工艺流程：①发酵液的pH值对柠檬酸生成影响很大；pH2~3时，发酵产物主要是柠檬酸；pH值中性或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸；②可往培养基中加入亚铁氰化钾或采取育种手段改造菌种，使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低活性，以阻碍TCA循环的正常进行，从而增加柠檬酸的积累。第63页/共106页第63页/共107页四、柠檬酸发酵用原料

柠檬酸发酵的原料有三大类糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等)正烷烃类原料。

第64页/共106页第64页/共107页营养物浓度对发酵的影响对生成量和组成都有影响黑曲霉柠檬酸发酵蔗糖浓度15%~18%，蔗糖同化率97%蔗糖浓度20%，只同化92%蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸第65页/共106页第65页/共107页五、柠檬酸发酵工艺

1)

试管斜面菌种培养

察氏琼脂培养基：NaNO3

3g，

蔗糖20g，

K2HPO4

1g，

KCl

0.5g，

MgSO4.7

H2O

0.5g，

FeSO4

0.01g，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml，

pH自然。

察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO3

2g，

MgSO4.7H2O

0.5g，

KH2PO4

1g，

KCl

0.5g，

FeSO4.7H2O

0.01g，

溴甲分绿0.4g，琼脂20g，

蒸馏水1000ml，

pH自然。第66页/共106页第66页/共107页1)

试管斜面菌种培养

蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，

NH4NO3

2g，

KH2PO4

2g，

MgSO4.7H2O

0.25g，

FeCl3.6H2O

0.02g，

MnSO4.4H2O

0.02g，

麦芽汁20ml，

琼脂20g，

用水定溶至1000ml。

米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。第67页/共106页第67页/共107页2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养a

培养基

有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7˚BX，氯化铵2%，尿素0.1%，

第68页/共106页第68页/共107页2)

种子扩大培养

①

二级扩大培养b

培养

固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。

液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。第69页/共106页第69页/共107页②

三级扩大培养可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂固体培养。

所用培养基如下：

a

麸曲培养基：

新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。

b琼脂固体培养基：

与斜面培养基相同。第70页/共106页第70页/共107页现代工业化大生产主要采用深层通风发酵法。日本约1／5的柠檬酸产品是利用固态发酵法生产的，浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克．波兰、保加利亚、阿根廷等国家主要使用，我国、美国及西欧共同体国家则主要采用液体深层发酵法进行生产第71页/共106页第71页/共107页3）

发酵生产

①

工艺流程

第72页/共106页第72页/共107页以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：

斜面菌种→麸曲瓶→种子

↓

薯干粉→调浆→灭菌(间歇或连续式)→冷却→发酵→发酵液→提取→成品

↑

无菌空气

薯渣为原料的固体发酵工艺流程：

试管斜面→三角瓶菌种→种曲

↓

薯渣→粉碎→蒸煮→摊凉接种→装盘→发酵→出曲→提取→成品

↑

米糠

3）

发酵生产

①

工艺流程

第73页/共106页第73页/共107页②

柠檬酸的深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面

茄子瓶种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）发酵培养（32℃，5～5.5天）成熟的发酵液（或10～20麦芽汁＋0.1%KH2PO4）16％的薯干粉，α-淀粉酶液化第74页/共106页第74页/共107页②

液体发酵

a不置换法培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。第75页/共106页第75页/共107页具体操作：接种后，培养温度维持在35℃，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50℃的空气以维持35℃的培养温度，通风量为3~5m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40℃左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。第76页/共106页第76页/共107页接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在26~28℃，以利柠檬酸的形成。因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至15~18m3/m2.h，且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。第77页/共106页第77页/共107页b

置换法置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。第78页/共106页第78页/共107页培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在34~36℃，培养液品温为32~34℃，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至30~32℃，待发酵48~60h后再放掉发酵液，加入新培养液即进行第2次置换。如此重复，一般可置换培养基8~10次，总发酵周期为14~20d，收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。第79页/共106页第79页/共107页置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培养基。但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。第80页/共106页第80页/共107页c

不置换法影响表面发酵的因素a)

培养液层厚度

培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度;相反，就应减少液层厚度。第81页/共106页第81页/共107页c

不置换法影响表面发酵的因素b)

糖浓度

用于表面发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%~22%较适宜，而质劣的糖蜜一般采用14%。在表面发酵中，大约80%的糖被用于合成柠檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副产物。第82页/共106页第82页/共107页c)

温度黑曲霉生长最适温度33-37℃，积累柠檬酸的最适温度在32℃黑曲霉适宜产酸温度是26~28℃。温度高，容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度低，发酵周期被延长。第83页/共106页第83页/共107页d)

pH值

黑曲霉长菌的最适pH为中性，而产酸的最适pH在2.5~2.0。因此，应该注意的是：菌盖形成之后，只是在菌盖下面有一个低pH区域，菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内进行的，所以不应该搅动发酵液，避免低值区域的pH值上升而长菌不产酸。第84页/共106页第84页/共107页黑曲霉发酵柠檬酸，pH3.0以下积累柠檬酸，pH3.0以上积累草酸，pH5.0容易积累葡萄糖酸与不同碳源有关，黑曲霉在合成培养基上产柠檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯干粉4.5第85页/共106页第85页/共107页e)

通风

表面发酵是气相传氧，因此传氧效率较高，所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可以满足霉菌对氧的需要。较高度的CO2会影响菌体的生长和降低产酸能力。一般将CO2控制在3%以下。第86页/共106页第86页/共107页第87页/共106页第87页/共107页②

固体发酵

a

浅盘发酵第88页/共106页第88页/共107页将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐渐下降，在入室后自18h内，应维持品温在27~31℃。培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在35℃左右，直至发酵结束。②

固体发酵

a

浅盘发酵第89页/共106页第89页/共107页为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻曲。曲室相对湿度在85%~90%。发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次，在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。第90页/共106页第90页/共107页b

厚层通风发酵第91页/共106页第91页/共107页与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的15~20cm要大出许多。为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械通风。b

厚层通风发酵第92页/共106页第92页/共107页培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似，但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻料。厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少，污染杂菌可能性小，机械化程度高。第93页/共106页第93页/共107页六、固定化黑曲霉发酵玉米生产柠檬酸用固定化黑曲霉细胞发酵玉米生产柠檬酸的最适温度是35℃,玉米糖液浓度10Bx。在最适条件下柠檬酸产量可达到96g/L,一般稳定在89g/L。第94页/共106页第94页/共107页六、固定化黑曲霉发酵玉米生产柠檬酸固定化黑曲霉可连续使用24d(约8批次)。黑曲霉细胞固定化后,产酸活力与降糖能力均与游离细胞水平相近。但在连续分批发酵中,固定化黑曲霉细胞显示出明显的优势,即:游离细胞连续使用2批次后,柠檬酸产量迅速下降,而固定化黑曲霉使用8