生物分开工程复习笔记

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内容：

1.生物分开工程概念、特点、操作流程等；

2.生物分开中常用到的分开操作方法，其概念、原理、特征、适用对象、本卷须知、优缺点、使用实例等；3.常用方法的比较；

基本知识点（一）

一．生物分开工程概述1，生物分开工程（P1）

生物分开工程是指从发酵液、反应液或动植物细胞培养液中分开、纯化生物产品的过程。它描述了生物产品分开、纯化过程的原理、方法和设备，又称为生物工程下游技术。

特征：应用面广;种类繁多，结构功能繁杂，生物活性各异;目的产物在初始物料中的含量低;原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分开过程成本越大;始物料成分繁杂,常需多个步骤,产品总收率低;易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感；产品的质量要求高，特别是药品等

2.传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异（P1）（了解）

1）传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)．其理化性能(如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

2）由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了好多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。

3）大分子(蛋白质)的分开主要困难在于杂蛋白的分开，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相像，分开主要依靠高分辩力的精制方法，如色谱分开等。

3.生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作（P4）1）一般工艺流程

一般来说，下游加工过程含培养液（发酵液）的预处理和固液分开；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；最终纯化。

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2）具体过程

1发酵液预处理和固液分开○

过滤和离心是预处理最基本的单元操作。由于发酵液的粘度高，所以分开之前要对发酵液进行预处理，主要采用凝聚和絮凝等技术来加速固、液相分开。在固液分开的方法、设备上，除可用鼓式真空过滤机外，较好的方法是采用错流膜过滤技术——改变发酵液的性质，以利于固液分开。

2细胞破碎及其碎片的分开○

细胞破碎方法：机械、生物、化学。大规模生产，高压匀浆机（利用液相剪切力和固定表面撞击所产生的应力）和珠磨机（依靠研磨），二者机理不同，但可相互补充。

碎片分开方法：一般为离心分开，两水相萃取（新方法，使细胞碎片集中分布在下相中）。3初步纯化（提取）○

主要是除去与目标产物性质有很大差异的物质，一般会发生显著的浓缩和产品质量的增加。方法：吸附法、沉淀法、离子交换法、萃取法（溶剂萃取、两水相萃取、超临界流体萃取、逆胶束萃取等）、膜过滤法（超滤、微滤等）。4高度纯化（精制）○

对产物有高度的选择性。主要目的除去与被纯化物有类似化学功能和物理性质的不纯物。色谱分开(离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等)、电泳、结晶等。5最终纯化○

产物的最终用途决定了产品最终的加工方法，常用的方法是浓缩、无菌过滤和去热原、结晶、枯燥。（凝胶色谱法、高效液相色谱法，处理量少，一般应用于最终纯化）。

2.选择纯化方法的依据（P9）

目标：高回收率、高产率、低成本

根据：目标蛋白质和咋蛋白质在物理、化学和生物学方面性质的差异，特别是表面性质的差异。（表面电荷密度（滴定曲线）、对一些配基的生物特异性、表面疏水性、表面金属离子、糖含量、自由巯基数目、分子大小和形状（相对分子量）、pH值和稳定性）。基本原则：尽可能简单、低耗、高效、快速；分开步骤尽可能少，每步收率尽可能高（分开步骤越多，回收率越低；分开步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长）；避免一致原理的分开技术屡屡重复出现；尽量减少新化合物进入待分开的溶液；合理的分

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离步骤次序（先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本）。

注：当几种方法连用的时候，最好以不同的分开机制为基础，经前一种方法处理后的液体适合于后一种方法处理，不需要经过脱盐、浓缩等处理。另亲和层析选择性最强，不用于第一步（杂质多，简单使得介质污染，使用寿命降低，体积较大需要大量的介质，成本高）。

3.非蛋白类杂质的去除（P9）

DNA：主要依靠电荷差异分开，有离子交换法、亲和层析、疏水层析等

热原质（主要是肠杆菌科所产生的细菌内毒素）：最好的方法是防止产生热原质。传统的去热原质的方法不适合蛋白质的生产，用超滤或反渗透的方法去热原适用于小分子量的多肽或蛋白质，对大分子蛋白质无效。

病毒：经过色层分开（如离子交换层析）一般能够将病毒去除，必要时可以采用紫外线照射或过滤使病毒失活或除去。

4.目标蛋白质的表征和分析方法（P10）

蛋白质在分开、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，仅用一种分析方法是不够的，常需用几种方法。HPLC选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和离子交换层析)，如只得到单个对称峰则说明纯度较高；

聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦；

序列分析：N·端和C端顺序分析可用来表征蛋白质：

其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质和标准品一致的证明。

二．发酵液的预处理和固液分开方法（P13）1.发酵预处理概述

1）概念：以细胞培养液或发酵液为出发点，设法使目标产物转移到液相中，同时除去其

它悬浮颗粒以及改善滤液性状以利于后续操作的过程称为发酵液的预处理。

2）策略：

胞外产物：应尽可能转移到液相中，常用调pH至酸性或碱性的方法来达到。胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物质释放到液相，再分开细胞碎片。寻常，以含生化物质的液相为出发点，进行后继操作。

3）目标：

改变发酵液中固体粒子的物理性质，如降低溶液的粘度，增加固体粒子的大小等，促进从悬浮液中分开固形物的速度，实现工业规模的过滤。尽可能使产物转入便于后处理的相中（液相）。去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。

4）要求和方向：

菌体分开；固体悬浮物的去除；蛋白质杂质的去除；重金属离子的去除；色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除；改变发酵液的性质，便于后续的分开提取；调理适合的pH和温度。

发酵液杂质：高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）（采用离子交换提纯时，会影响树脂对

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目标产物的交换容量），杂蛋白质（离子交换法和大网格树脂吸附法提取时，会降低吸附能力。

有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分开不完全。常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，膜受到污染）。

2.发酵液预处理方法

1）加热法:降低发酵液粘度，注意控制温度和时间。2）调理pH值和去除高价无机离子的方法：1为了改变发酵液的胶体状态或使产物转入液相，○往往要调整它的pH值，一般用草酸酸化。

草酸溶解度小，用量大时，可用其盐，如草酸钠。草酸价格较贵，注意回收（四环类抗生素废液中，参与硫酸铅，在60℃下生成草酸铅。后者在90-95℃下用硫酸分解经过滤、冷却、结晶后可回收草酸）。

2去除钙离子：一般用草酸的钠盐生成草酸钙↓，草酸钙能促进蛋白质凝固，提高滤液的○

质量。

3去除镁离子：参与三聚磷酸钠，它和镁离子形成沉淀：用磷酸盐处理，也能大大降低钙○

离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提炼。

4去除铁离子：可参与黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀（3K4Fe(CN)6＋4FeCl3→12KCl＋○

Fe4[Fe(CN)6]3↓）。

3）加水稀释法4)参与助滤剂法

5)色素及其他杂质的去除方法6)加吸附剂法或加盐法7)可溶性杂蛋白的去除法

等电点沉淀：蛋白质在碱性溶液里带负电，在酸性溶液里带正电，在等电点处得溶解度最小。

使杂蛋白质变性热变性法（变性蛋白质的溶解度较小）：加热，液体粘度降低，加快过滤速度；大幅度调理pH值，酸性条件下去除杂蛋白较多；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等，只适合发酵液量少的场合。不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法寻常只适用于所处理的液体数量较少的场合。

利用吸附作用沉淀蛋白质；参与蛋白质沉淀剂

8）凝聚（集）和絮凝技术

1凝聚作用是在某些电解质作用下，如中性盐作用下，使扩散双电层的排斥电位降概念：○

低，破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。

2有机高分子聚合物絮凝剂通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，猛烈地吸附在○

胶粒的表面，一个高分子聚合物的大量链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。

3混凝是在料液中，先参与无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成○

微粒，而后再参与絮凝剂的操作过程。将絮凝和凝聚结合起来的过程。

4凝聚价：○使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(mmol/L)，表示电解质的凝聚能力，反

离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。

胶粒能保持分散状态的原因：

扩散双电层（ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征）的结构：一旦由于布朗(Brown)运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥作

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用，阻止了粒子的聚集。ζ电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大。水化层：由于胶粒表面的水化作用，形成了水化层，也能阻碍直接聚集。水化膜主要是伴随胶粒带电而引起，一旦ζ电位降低或消失，水化层也会随之减弱或消失。

絮凝作用：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生架桥作用，而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，它是一种以物理的集合为主的过程。优点：采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分开。不仅可以提高过滤速度，还能有效去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高滤液质量。

絮凝剂：无机絮凝剂（硫酸铝、氯化钙等和一些无机高分子聚合物，如聚合铝盐和聚合铁

盐等。）有机絮凝剂：主要有中性、阴性和阳性絮凝剂，包括：自然高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等）和人工合成的高分子絮凝剂（聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类、聚乙烯亚胺类）。微生物絮凝剂和自然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。

凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，

增大体积，以便于过滤。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。

影响絮凝效果的因素：絮凝剂浓度；絮凝剂分子量；絮凝剂类型；溶液的pH；搅拌速度

和时间（参与絮凝剂初期应高转速，使絮凝剂快速均匀分散到料液中，不形成局部过浓，但接着应当低速搅拌，利于絮凝体长大成团）；助凝剂

3.固液分开（P18）

1）目的：○1收集含胞内产物的细胞或菌体，分开除去液相；○2收集含生化物质的液

相，分开除去固体悬浮物。常用方法过滤和离心分开。

2）影响固液分开的因素

主要取决于细胞或菌体的大小、形状及介质的粘度。发酵液中悬浮粒子的大小（粒子越小，分开难度越大，费用成本越高）；菌种；细胞培养液的粘度（培养条件、放罐时间、发酵染菌、发酵pH和温度）。

3）过滤（P19）

概念：借助于过滤介质，在一定的压力差作用下，将悬浮液中的固体粒子截留，而与液体分开的技术。

滤饼的质量比阻rB：衡量过滤特性的主要指标，表示单位滤饼厚度的阻力系数。

滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。因此开始过滤时应注意不能很快提高压差，寻常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地逐步地升高压力，一般在相当长的时间内，压力差不要超过0.05MPa，最终的压差(不包括榨滤)也不超过0.3一0.4MPa。

1板框式压滤机，过滤面积大，过滤推动力能够大幅度进行调整，耐受较高的过滤设备：○

压力差，结构简单，价格较低，动力消耗少，但不能够连续操作，设备笨重，劳动强度大，

2鼓式真空过滤机，能够连续操作，并能够实现自动卫生条件差，非生产的辅助时间长；○

化控制，但压差较小，主要是用于霉菌发酵液的过滤。对菌体较细或粘稠的发酵液不太适用。对于放线菌发酵液的过滤可采用加一层助滤剂。

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定在交联琼脂糖凝胶中制得蛋白质吸附剂，可以用来分开分子量或电荷量十分接近的蛋白质。如麦芽外源凝聚素（WGA，分子量36000）和琥珀酰麦芽外源凝聚素（Suc-WGA）的分开。

8.凝胶层析法

1凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，分子直径比凝胶孔径大的分子，不能○

进入凝胶颗粒的微孔里，只能随溶剂一起移动的，最先流出柱外；分子直径比凝胶孔径小的分子，即进入凝胶相内，延长了路径，向下移动的速度落后于大分子。——操作便利，不会使物质变性，层析介质不需再生，可反复利用。用于脱盐，生物大分子按分子大小分级分开以及分子量测定。

2表示凝胶过滤介质特征的参数○

排阻极限：不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量；分级范围：指出了当溶液通过凝胶柱的时候，能够为介质阻滞并且分开的溶质分子量范围。吸水量：凝胶层析介质使用前需要溶胀，溶胀后1g干凝胶所吸收的水分。（凝胶型号中的数字是吸水量乘以10）。凝胶颗粒大小（凝胶颗粒一般为球形，可以用筛目表示，也可以用珠体直径表示）。床体积：表示1g干凝胶在溶胀后所具有的最终体积。可用来估计凝胶装柱后的床层体积。空隙体积：表示填充柱中凝胶粒子周边的总空间。

3凝胶层析操作：凝胶选择（粗中者用于生产，细者用于科研和提纯，极细者装柱后简单○

堵塞，影响流速，不用于一般凝胶分开）—装柱（一般修长柱）—上样—洗脱（洗脱液成分应当与膨胀胶所用液体一致，一般操作压力大，流速快，太大，凝胶会压缩，流速很快减慢）—凝胶再生和保养

凝胶的前处理：溶胀（十倍蒸馏水）—碱洗（0.5NaOH）—酸洗（0.5HCL）—平衡（起始缓冲液）。

9.电泳法1）基本概念1电泳法：○靠溶质在电场移动中移动速度不同而分开的方法。溶质要必需带电，本身是离

子或是表面吸附离子而带电。电泳中由于通电发热等原因引起的对流，会使已经分开的溶质重新混合，为防止对流，可将电泳在多孔介质（为载体，多为凝胶）中进行，称区带电泳。

2电渗：在电场中，液体对于一个固定固体的相対移动。单位电场强度的电渗速度为电渗○

迁移率。对于阳离子需将所测得的迁移率减去电渗迁移率，而阴离子则加上。

3凝胶电泳与凝胶过滤的区别：在凝胶电泳中样品混合物中各分子的运动速度时小分○

子大于大分子，与凝胶过滤相反。在凝胶电泳中，系统里面没有空隙体积，只有充满整个凝胶连续的网状结构，在内部大分子较小分子不简单移动。

2）聚丙烯酰胺电泳

1聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），有两种形○

式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质保持完整形态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及所带的电荷量逐渐呈梯度分开。

SDS蛋白质（亚基）的电泳迁移率主要取决于蛋白质（亚基）分子量的大小，分子形状和电荷因素可以忽略。

2不连续电泳分为两层，上层为浓缩胶，下层为分开胶。浓缩胶的作用是堆积。浓缩胶浓○

度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

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3蛋白质以相等的迁移速度从浓缩胶进入分开胶。由于SDS的结合，蛋白质具有相像的形○

状和电荷密度；由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以简单的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分开。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

七、结晶法1.基本概念

1）结晶：溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学

成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列。2）适用范围和特点：只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。结晶过程具有成本低、设备简单、操作便利，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素等产品的精制。

3）沉淀和结晶：固体有结晶和无定形两种状态。结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时

间进行排列，粒子排列有规则—结晶；无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则—沉淀。沉淀和结晶的过程本质上一样，都是新相形成的过程。

4）过饱和溶液及凯尔文公式

饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

溶质只有在过饱和溶液中才能析出；溶质溶解度与温度、溶质分散度（晶体大小）有关。过饱和度：S=c/c*（过饱和程度寻常用过饱和溶液的浓度c与饱和溶液c'的比值表示）。

2.结晶（P184）

1）结晶过程：形成过饱和溶液（结晶的前提）—晶核形成—晶体生长。过饱和度是结晶

的推动力。

2）饱和曲线：

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3）过饱和溶液的形成（P184）：

1热饱和溶液冷却（等溶剂结晶），适用于溶解度随温度降低而显著减小的体系。自然○

冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液