现代生物技术酶工程

现代生物技术酶工程第1页，共106页，2023年，2月20日，星期日酶工程概述1酶的生产与分离纯化2

酶反应器和酶传感器5第五章酶工程

化学修饰酶与化学人工酶3固定化酶4第2页，共106页，2023年，2月20日，星期日第一节酶工程的概述酶工程（enzymeengineering)又称酶技术，是指利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，它是酶学理论与化学技术相结合而形成的一门新技术。酶工程是生物工程的重要组成部分，它与基因工程、细胞工程、发酵工程相互依存、相互促进，它们在生物工程的研究、开发和产业化过程中要靠彼此合作来实现。第3页，共106页，2023年，2月20日，星期日酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系基因工程基因工程菌发酵工程酶酶工程细胞工程酶转基因动物转基因植物菌体细胞固定化菌体细胞细胞第4页，共106页，2023年，2月20日，星期日

一、酶工程的内容1.酶工程的分类：（1）化学酶工程：自然酶、化学修饰酶、固定化酶、化学人工酶的研究和应用。（2）生物工程酶：①用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；②修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；③设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。第5页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.酶工程的内容（1）酶的产生

酶制剂的来源，有微生物、动物和植物，但是，主要的来源是微生物。由于微生物比动植物具有更多的优点，因此，一般选用优良的产酶菌株，通过发酵来产生酶。为了提高发酵液中的酶浓度，选育优良菌株、研制基因工程菌、优化发酵条件。工业生产需要特殊性能的新型酶，如耐高温的α—淀粉酶、耐碱性的蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要研究、开发生产特殊性能新型酶的菌株。第6页，共106页，2023年，2月20日，星期日

（2）酶的制备

酶的分离提纯技术是当前生物技术“后处理工艺”的核心。采用各种分离提纯技术，从微生物细胞及其发酵液，或动、植物细胞及其培养液中分离提纯酶，制成高活性的不同纯度的酶制剂，为了使酶制剂更广泛地应用于国民经济各个方面，必须提高酶制剂的活性、纯度和收率，需要研究新的分离提纯技术。第7页，共106页，2023年，2月20日，星期日（3）酶和细胞固定化

酶和细胞固定化研究是酶工程的中心任务。为了提高酶的稳定性，重复使用酶制剂，扩大酶制剂的应用范围，采用各种固定化方法对酶进行固定化，制备了固定化酶，如固定化葡萄糖异构酶、固定化氨基酰化酶等，测定固定化酶的各种性质，并对固定化酶作各方面的应用与开发研究。目前固定化酶仍具有强大的生命力。它受到生物化学、化学工程、微生物、高分子、医学等各领域的高度重视。第8页，共106页，2023年，2月20日，星期日（3）酶和细胞固定化固定化细胞是在固定化酶的基础发发展起来的。用各种固定化方法对微生物细胞、动物细胞和植物细胞进行固定化，制成各种固定化生物细胞.研究固定化细胞的酶学性质，特别是动力学性质，研究与开发固定化细胞在各方面的应用，是当今酶工程的一个热门课题。固定化技术是酶技术现代化的一个重要里程碑，是克服天然酶在工业应用方面的不足之处，而又发挥酶反应特点的突破性技术。可以说没有固定化技术的开发，就没有现代的酶技术。第9页，共106页，2023年，2月20日，星期日（4）酶分子改造

又称为酶分子修饰。为了提高酶的稳定性，降低抗原性，延长药用菌在机体内的半衰期，采用各种修饰方法对酶分子结构进行改造，以便创造出天然酶所不具备的某些优良特性(如较高的稳定性、无抗原性、抗蛋白酶水解等)，甚至于创造出新的酶活性，扩大酶的应用，从而提高酶的应用价值，达到较大的经济效益和社会效益。第10页，共106页，2023年，2月20日，星期日（4）酶分子改造

酶分子改造可以从两个方面进行：

(1)用蛋白质工程技术对酶分子结构基因进行改造，期望获得一级结构和空间结构较为合理的具有优良特性、高活性的新酶(突变酶)。(2)用化学法或酶法改造酶蛋白的一级结构，或者用化学修饰法对酶分子中侧链基团进行化学修饰．以便改变酶学性质。这类酶在酶学基础研究上和医药上特别有用。第11页，共106页，2023年，2月20日，星期日

（5）有机介质中的酶反应由于酶在有机介质中的催化反应具有许多优点。因此，近年来，酶在有机介质中催化反应的研究，已受到不少人的重视，成为酶工程中一个新的发展方向。酶在有机介质中要呈现很高的活性，必须具备哪些条件?有机介质对酶的性质有哪些影响?如何影响?近年来，对这些问题的研究，已取得重要进展。第12页，共106页，2023年，2月20日，星期日（6）酶传感器

又称为酶电极。酶电极是由感受器(如固定化酶)和换能器(如离子选择性电极)所组成的一种分析装置，用于测定混合物溶液中某种物质的浓度，其研究内容包括：酶电极的种类、结构与原理；酶电极的制备、性质及应用。第13页，共106页，2023年，2月20日，星期日（7）酶反应器酶反应器是完成酶促反应的装置。其研究内容包括：酶反应器的类型及特性；酶反应器的设计、制造及选择等。第14页，共106页，2023年，2月20日，星期日（8）抗体酶、人工酶和模拟酶

抗体酶是一类具有催化活性的抗体。是抗体的高度专一性与酶的高效催化能力二者巧妙结合的产物。其研究内容是：抗体酶的制备、结构、特性、作用机理、催化反应类型、应用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白质。据1977年Dhar等人报道，人工合成的Glu—Phe—Ala—Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的50%。利用有机化学合成的方法合成了—

些比酶结构简单得多的具有催化功能的非蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程。既可以达到酶催化的高效率，又能够克服酶的不稳定性。这样的物质称为模拟酶。用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶等多种酶。第15页，共106页，2023年，2月20日，星期日（9）酶技术的应用在医学、食品、发酵、纺织、制革、化学分析、氨基酸合成、有机酸合成、半合成抗生素合成、能源开发以及环境工程等方面的应用都很广泛。①运用酶技术生产有重要价值的产品。②利用酶制剂改进生产工艺，提高产品质量和产率，降低生产成本。第16页，共106页，2023年，2月20日，星期日二、酶工程的意义、发展及展望1.酶工程的研究意义一切生物的生命活动都是由新陈代谢的正常运转来维持的，而代谢中的各种化学反应是由各种酶的催化来实现的。没有酶，代谢就会停止，生命亦就停止。个别酶的缺乏或者酶活性受到抑制就会使代谢受阻或紊乱，从而引起疾病。因此，研究酶的结构与功能以及动力学，对于阐明生命的本质和活动规律，对于阐明发病机理以及诊断治疗，具有极其重要的作用。由于酶是生物催化剂，与化学催化剂相比．既有共性，又有个性。因此，对酶的研究成果必然能充实，发展催化剂理论，而且，还能为催化剂设计、药物设计、疾病的诊断治疗，提供重要的依据和新思想、新概念。第17页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.酶工程的研究意义有些酶是蛋白质和核酸一级结构测定和基因工程研究的重要工具。例如：胰蛋白酶羧肽酶，脂肪酶等作为测定蛋白质一级结构的工具酶；限制性内切酶、T7DNA聚合酶、核糖核酸酶、核酸酶等作为测定核酸一圾结构的工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶，TaqDNA聚合酶等作为基因工程的工具酶。由此可见，工具酶是研究分子生物学的重要手段之一。它在一定程度上推动了分子生物学的发展。酶技术在工农业生产上已有日益广泛的应用，产生了较大的经济效益和社会效益。第18页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.酶工程的研究进展

两个方向：酶的应用研究、酶技术研究；酶的理论研究。

（1）酶的应用研究进展1926年，索姆奈(Sumner)首次从刀豆中制备出脲酶结晶，并提出，酶是具有催化能力的蛋白质。从此以后．人们开展了各种酶的分离提纯的研究，制备了各种不同规格的酶制剂。从20世纪“50年代起，大规模工业生产的酶制剂品种愈来愈多。现在，α—淀粉酶、糖化酶、葡萄搪异构酶、果胶酶、凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶、各种蛋白酶等，已经实用化、商品化。上述酶制剂在食品加工，发酵上业，制革工业，纺织工业，氨基酸、有机酸和半合成抗生素的合成工业，医疗卫生，能源开发以及环境工程中、有日益广泛的应用，发挥了重要的作用。第19页，共106页，2023年，2月20日，星期日酶工程是在人类原始的应用酶的催化作用的基础上逐渐发展起来的。二十世纪以来，特别是二十世纪五十年代以来，酶的应用技术有了很大的进步。五十年代酶制剂的生产有了迅速发展，这一时期主要是溶液酶的应用；六十年代出现了固定化酶技术，六十年代来已应用于工业生产；七十年代出现了固定化细胞的技术，至目前又发展了固定化增增细胞的研究，亦发展了包括辅助因子再生的固定化多酶反应体系的研究。人类原始应用酶的催化作用可谓源远流长。我国劳动人民在四千年前已掌握了酿酒技术，商朝的酿酒业已相当发达，秦汉前已将麦芽用于制造饴糖等等。但是直到十九世纪人们才逐渐建立起“酶”的概念。1908年罗门等利用胰酶鞣制皮革，1917年法国人博伊丁和埃芬特用枯草杆菌产生的淀粉酶用作纺织工业上的退浆剂。此后酶在工业上应用的研究逐渐深入到很多工业部门。到了1949年，由于日本采用深层培养法生产细菌α—淀粉酶获得成功，才使酶制剂的生产和应用进入工业化的阶段。第20页，共106页，2023年，2月20日，星期日从此，蛋白酶、果胶酶、转化酶等相继投入市场。1959年由于采用葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡聚糖的新工艺研究成功．彻底革除了原来葡萄糖生产中需要高温高压的酸水解工艺，使淀粉得糖率由80%提高到l00％，致使日本1960年的精制葡萄糖产量猛增10倍。由于这项改革的成功，大大促进了酶在工业上应用的发展，先后出现了不少成功的应用实例。如5’-磷酸二酯酶用于5’-核苷酸的生产，用青霉素酰胺酶制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)，氨基酰化酶拆分DL-氨基酸，9-酪氨酸酶催化生产L-多巴等等。五十年代，尽管酶的应用有很大发展，但与酶学研究的进展相比，其发展还是缓慢的，主要原因是酶的生产和应用技术落后。由于酶的分离纯化比较复杂，分离的酶稳定性显著下降，并且采用在水溶液中分批反应，反应后的酶很难回收，致使成本很高，阻得了酶应用的进一步发展。第21页，共106页，2023年，2月20日，星期日从应用的目的出发，Crubhofer和Schleith从1953年开始研究酶的固定化。他们将胃蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶和核糖核酸酶等结合在重氮化的树脂上，实现了酶的固定化。1969年，日本千佃一郎首次应用固定化氨基酰化酶大规模生产L-氨基酸。从此以后．固定化酶研究十分活跃，进展很快。现在、已有十多种固定化酶用于工业生产。例如：利用固定化葡萄糖异构酶生产高果葡萄浆；利用固定化青霉素酰化酶生产6-氨基青霉烷酸；利用固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等。但是，大多数固定化酶的应用研究，仍处于实验室研究阶段或中试生产阶段，要用于工业生产上有待进一步研究。为了减少从微生物细胞中分离提纯酶的麻烦，或者有目的地利用微生物细胞内的复合酶系统，从70年代初起，人们直接对微生物细胞进行固定化研究.1973年，干佃一郎首次利用固定化大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。从此以后，微生物细胞固定化研究十分活跃，进展很快。现在，已有愈来愈多的固定化微生物细胞用于工业生产。例如：固定化大肠杆菌细胞生产6-氨基青霉烷酸；固定化产氨短杆菌细胞生产L—苹果酸；固定化假单孢菌细胞生产L-丙氨酸；固定化链霉菌细胞生产果葡糖浆；固定化酿酒酵母细胞生产酒精等。但是，大多数固定化微生物细胞的应用研究，尚处于实验室研究阶段或小试生产阶段，向待进一少研究。第22页，共106页，2023年，2月20日，星期日因为固定化细胞对结构复杂、化学合成困难的化合物的生产特别有用，所以近年来已成为酶工程研究中引人注目的领域。并且用固定化细胞己进行了不少有用化合物的试生产，包括有机酸、氨基酸、抗生素和辅酶等。例如固定化产氨短杆菌可以通过五步酶反应连续合成辅酶A。1983年在英国伦敦召开的生物工程会议上，日本人小田等介绍了用海藻酸钙和光交联树脂两种方法固定化酵母的增殖细胞连续生产酒精的研究报告，他们在试验工厂中用4千升的流动柱床反应器，以甘蔗糖蜜生产酒精，在柱反应器流出液中酒精浓度可达到8.5—9.0％，每千升的反应器每天能生产纯酒精600升．酒精的转化率达到理论值的95％，生产能力超过常规分批式发酵工艺的20倍。用海藻酸钙包埋的酵母工作稳定性达4个月以上，用光交联树脂固定的酵母细胞工作稳定性达2年以上。固定化增殖酵母细胞用于连续化生产酒精的工艺目前己由实验室转到实验工厂，看来实现工业化生产是很有希望的。固定化增殖细胞用于处理废水现在已经达到工业应用的水平。第23页，共106页，2023年，2月20日，星期日微生物细胞固定化研究，已从利用—种酶反应的固定化死菌体，发展到利用多酶反应的固定化活菌体，从固定化休眠菌体、饥饿菌体发展到固定化增殖茵体。最近，还发展到固定化基因工程菌。从80年代起，人们开始把目光放到动物细胞和植物细胞固定化上。动物和植物细胞固定化，虽然比微生物细胞固d定化难得多，但是，它们能产生微生物难以产生的贵重药物，如：乙肝病毒表面抗原、单克隆抗体、人参皂苷等，目前，动物细胞和植物细胞的固定化研究，尚处于实验室研究阶段或中试阶段，需要深入研究。50年代末到60年代，人们致力于用小分子化合物修改酶分子中的氨基酸残基侧链基团，以研究一些酶活性基团的情况，得到了很有价值的数据。第24页，共106页，2023年，2月20日，星期日较早用大分子物质修饰酶的是Katchalsko等人。他们用DEAE—右旋糖酐、多肽等修饰了酶，使酶的性质得到了改善。从70年代开始．随着研究的普遍进展，在修饰剂的选用、修饰方法上，都有新的发展。现在，有一些酶(如L-天门冬酰胺酶等)用大分子修饰剂修饰之后，其热稳定性提高，抗失活因子能力加强，抗原性消除，体内半衰期延长。由此可见，酶化学修饰在一定程度上可以克服天然酶的缺点，使其更适合于工业生产和医疗上的需要。近年来，人们对抗体酶、人工酶、模拟酶等；进行了研究，取得了一些进展，今后将进一步研究。随着固定化酶(或细胞)的研究进展，人们研究、设计、制造了各种各样的固定化酶反应器.其中，有一些巳应用于工业生产。目前．固定化酶反应器的应用，尚处于开发的早期阶段。其最终目标是实现全自动的最佳控制。第二代新型的固定化酶反应器，例如：能实现辅因子(辅酶Ⅰ和ATP等)再生的酶反应器、两相或多相酶反应器、组合酶反应器等，正在研制之中。第25页，共106页，2023年，2月20日，星期日自从1967年酶电极问世以来，酶电极的研究引起了不少人的极大兴趣。现在，不少酶电极已经实用化、商品化，用于测定混合物溶液中某种物质的浓度。例如：用葡萄糖氧化酶电极测定血液、尿、发酵液中的葡萄糖浓度；用脲酶电极测定血液中的尿素浓度。酶电极在临床化验、发酵生产、环境监测以及其他化学分析等方面，展示了广阔的前景。近年来，人们正在研制各种新型的酶电极，如多功能酶电极、微型酶电极、抗干扰酶电极等。酶标免疫分析是60年代发展起来的新的免疫测定技术。酶标免疫分析是以待测抗原(或抗体)与酶标抗体(或抗原)的专一性反应为基础，然后通过酶活力测定，来确定抗原(或抗体)含量的—类分析法。现在，已建立了各种酶标免疫分析法，用于测定血液中抗原或抗体的含量，有很高的灵敏度和准确度。第26页，共106页，2023年，2月20日，星期日（2）酶的理论研究进展(1)新酶的发现和鉴定

迄今为止,已发现的酶有25000多种，数千种酶被鉴定，并达到不同的纯度，数百种酶得到了结晶，数百种酶的一级结构被测出来。每年都有新酶被发现；每年都有不少酶的一级结构被测出。(2)酶一级结构与活力的关系

过去主要用化学修饰的方法研究酶一级结构与活力的关系，获得了不少的信息。近年来，除了继续用上述技术以外，还采用下列新技术对此问题作更深入的研究：①过渡态类似物技术②自杀性底物技术。③基因定位突变技术④计算机模拟技术等。(3)酶分子高级结构的测定一部分酶的高级结构已经被测出来，但是，还有大多数酶的高级结构尚待测定。第27页，共106页，2023年，2月20日，星期日对酶分子高级结构的测定，x-射线晶体结构分析法仍然是十分有效的方法。近年来，二维核磁共振技术的应用愈来愈广。后者可以测定溶液中酶分子构象及其变化过程。运用上述两种技术必将测出更多的酶分子构象。

(4)酶活性部位结构及催化机理的研究这是酶学研究的核心的问题。近年来，运用下列新技术研究酶活性部位结构及催化机理，取得了重大的进展.

①应用x-射线晶体结构分析技术研究酶一底物(或底物类似物)复合物结构，可以确定酶活性部位结构以及酶分子与底物分子的结合情况。②应用二维核磁共振技术可以确定酶活性部位上解离基团的pK值以及催化过程中的质子转移情况.③关于酶促反应动力学研究，现在已用电子计算机编程序，对酶与底物的作用方式以及底物反应过程中可能存在的酶分子形式，作出判断。

④应用隧道电镜技术可以观察到酶催化过程中质子转移和电子转移的情况。第28页，共106页，2023年，2月20日，星期日（3）我国固定化酶技术的发展和取得的成绩我国从事固定化酶的研究开始于1970年。中国科学院上海生物化学研究所及微生物研究所相继把染料工业中使用的双功能试剂对-硫酸酯乙砜基苯胺引入固定化酶领域，它与多糖如甘蔗渣纤维、交联琼脂、葡聚糖凝胶等反应，得到各种带有苯胺基的载体，然后在十分温和的条件下与酶共价偶联。1972年，上海生物化学研究所用这类载体ABSE(对氨基苯磺酰乙基)-葡聚糖凝胶共价结合红酵母的3’-核糖核酸酶，生产3’-核苷酸试剂。我国科研工作者还用这类载体共价结合了多种酶。这些固定化酶都得到满意的结果，发展成为颇具我国特点的固定化方法。1977年底，上海生物化学研究所与江门甘蔗化工厂、上海啤酒厂协作将固定化5’-磷酸二酯酶用于5’-核苷酸的生产，这使世界上工业上实用的固定化酶又增添了新的一员。中国科学院微生物所用固定化多核苷酸磷酸化酶稳定地用于制备多聚核苷酸，已在1978年下半年进行了鉴定。第29页，共106页，2023年，2月20日，星期日我国对固定化细胞的应用也进行了不少工作。上海生物化学研究所，上海第三制药厂和上海医药工业研究院用明胶戊二醛使具有青霉素酰胺酶活力的菌体固定化装柱连续生产6—氨基青霉烷酸7个月，活力几乎不变，达到世界先进水平。中国科学院微生物研究所与太原制药厂协作也成功地用琼脂、戊二醛包埋大肠杆菌用于工业生产6—氨基青霉烷酸．1978年12月化工部医药局对这二项工艺通过了鉴定。中国科学院微生物所于1977年和1979年分别用固定化菌体生产天门冬氨酸和苹果酸获得成功。近几年，不少单位采用固定化细胞和固定化酶生产高果糖浆的研究取得重要进展，准备工业生产。近年来，我国在辅酶的固定化、固定化酶在医疗和人工器官上的应用做了不少探索。固定化酶在分析及亲和层析方面的应用也取得了一些进展。如华北制药厂用固定化青霉素酶对青霉素效价的测定；上海生物化学研究所用固定化5’磷酸二酯酶和固定化碱性磷酸单酯酶进行寡核苷酸序列分析；北京大学曾试用固定化酶提纯胰蛋白酶抑制剂等等。第30页，共106页，2023年，2月20日，星期日第二节食品酶的生产与分离纯化第31页，共106页，2023年，2月20日，星期日酶的生产酶的提取酶的分离纯化制成酶制剂后直接利用制成固定化酶（或固定化细胞）后利用用于治疗疾病用于加工和生产一些产品用于化验诊断和水质临界测定用于生物技术其他分支领域酶制剂的利用酶制剂的生产第32页，共106页，2023年，2月20日，星期日

一、酶的生产酶的生产：经过预先设计，并且通过人工控制而获得所需要的酶的过程。3种方法：提取法、微生物发酵法、化学合成法。最常用的是微生物发酵法。第33页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.微生物发酵生产法的优点

①微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。②微生物生长繁殖快，生活周期短，酶的产量高。③微生物培养方法简单，生产原料来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高。④微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。第34页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.微生物发酵法制酶对生产菌的要求

①安全可靠，非致病菌，不会产生有毒物质。②产酶性能稳定，不易退化，不易感染噬菌体。③繁殖快，产酶量高，而且最好产生胞外酶。④能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。⑤产生的酶容易分离纯化。第35页，共106页，2023年，2月20日，星期日3.发酵方法与发酵条件

（1）发酵方法①固体发酵法：以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分（通常50%左右）进行的微生物培养。方法：浅盘法（培养基不超过5cm）转鼓法（培养基在转鼓内翻动）通气式厚发酵（培养基可达20～30mm）第36页，共106页，2023年，2月20日，星期日3.发酵方法与发酵条件

②液体发酵法：利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养的发酵方法。方法：间歇发酵法连续发酵法第37页，共106页，2023年，2月20日，星期日3.发酵方法与发酵条件（2）发酵条件的控制

发酵条件既要有利菌体生长繁殖，又不影响酶的形成。一般处理是先确定菌体生长的最适条件，然后作出调整以满足酶生成的需要。首先，培养基组成对菌的生长和酶的合成具有最直接的影响。其次，通风量、培养温度等因素不仅影响菌体生长，也影响酶的合成。一般来说在低于生长温度下产酶量高。培养温度还影响酶活力的稳定性。另外，在生产中掌握适宜酶的回收期时也很重要，对于大多数胞外酶来说，酶合成与菌株生长大致平行，生长停止时酶产量达最大，再培养酶产量多要下降。第38页，共106页，2023年，2月20日，星期日4.产酶常用的微生物（1）细菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等（2）放线菌：链霉菌（3）霉菌：黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等（4）酵母：啤酒酵母、假丝酵母第39页，共106页，2023年，2月20日，星期日5.微生物酶的发酵生产微生物酶的发酵生产：

在人工控制的条件下，有目的利用微生物培养来生产所需的酶。包括：培养基，发酵方式的选择，发酵条件的控制管理等。第40页，共106页，2023年，2月20日，星期日

（1）培养基①碳源②氮源③无机盐类④生长因子⑤pH第41页，共106页，2023年，2月20日，星期日

（2）酶的发酵生产方式①固体发酵：用于真菌的酶生产，如米曲霉生产淀粉酶，曲霉和毛霉生产蛋白酶。②液体深层发酵：控制发酵条件温度、通气和搅拌、pH等发酵条件。第42页，共106页，2023年，2月20日，星期日

（3）提高酶产量的措施①选育优良的产酶菌株②添加诱导物：酶的作用底物，酶的反应产物，酶的底物类似物。③降低阻遏物浓度④表面活性剂⑤添加产酶促进剂第43页，共106页，2023年，2月20日，星期日

二、酶的分离纯化酶的分离纯化：是指从微生物的发酵液或动植物组织提取液及细胞培养液中得到不同纯度、高质量的酶产品。酶分离纯化的方法是根据酶的蛋白质特性而建立的。第44页，共106页，2023年，2月20日，星期日酶的分离纯化细胞破碎酶的提取离心分离过滤与膜分离层析分离电泳分离萃取分离浓缩干燥结晶第45页，共106页，2023年，2月20日，星期日1、细胞破碎除胞外酶之外，绝大多数酶都存在于细胞内部。先收集细胞，破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化细胞破碎的方法：机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法等。第46页，共106页，2023年，2月20日，星期日

细胞破碎方法及原理分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法研磨法匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，从而使细胞破碎化学破碎法添加有机溶剂添加表面活性剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构破坏，而使细胞破碎第47页，共106页，2023年，2月20日，星期日2、酶的提取酶的提取过程就是在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。酶的提取方法：盐溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法等。第48页，共106页，2023年，2月20日，星期日

酶的主要提取方法提取方法用于提取的溶剂提取的酶的性质盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液在低盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂与脂类结合或者含较多非极性基团的酶第49页，共106页，2023年，2月20日，星期日2、酶的提取酶的提取过程就是在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。酶的提取方法：盐溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法等。第50页，共106页，2023年，2月20日，星期日3、酶的分离纯化酶的纯化就是把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来。包括：沉淀、过滤、层析、电泳、萃取、结晶、干燥等。第51页，共106页，2023年，2月20日，星期日4、沉淀分离沉淀分离就是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出而与其他溶质分离的技术过程。包括：盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法。第52页，共106页，2023年，2月20日，星期日沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用酶（蛋白质）在不同盐浓度下的溶解度不同的原理，使酶或者杂质析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性，调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些性质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离第53页，共106页，2023年，2月20日，星期日5、离心分离离心分离就是借助于离心机旋转所产生的离心力，使大小不同、密度不同的物质分离的技术过程。离心机：低速离心机、高速离心机、超速离心机。第54页，共106页，2023年，2月20日，星期日5、离心分离低速离心机：最大转速8000r/min。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。高速离心机：最大转速（1～2.5）×104r/min。用于细胞碎片和细胞器的分离超速离心机：最大转速（2.5～12）×104r/min。主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器和病毒的分离纯化、沉淀系数和相对分子质量的测定等。第55页，共106页，2023年，2月20日，星期日6、过滤分离过滤是借助于过滤介质将大小不同、形状不同的物质分离的技术过程。过滤介质：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。过滤类型：膜过滤（微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜作为过滤介质），非膜过滤（将粗滤及部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质）。第56页，共106页，2023年，2月20日，星期日过滤的种类及特性类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤＞2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微过滤、微孔陶瓷超滤20A至2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透＜20A生物小分子、盐、离子等反渗透膜第57页，共106页，2023年，2月20日，星期日7、层析分离层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中。其中一个相为固定相，另一个相为流动相，当流动相流经固定相时，各组分以不同发速度移动，从而使不同的组分分离纯化。第58页，共106页，2023年，2月20日，星期日层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离第59页，共106页，2023年，2月20日，星期日8、电泳分离带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。物质颗粒在电场中的移动方向：带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒向阳极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状、大小、电场强度、溶液的pH、离子强度、支持体的特性等外界条件的影响。第60页，共106页，2023年，2月20日，星期日8、电泳分离电泳的方法：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳等。在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶的分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。第61页，共106页，2023年，2月20日，星期日9、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。两相指的是互不相溶的两个液相或其他液体。按照两相的组成不同，萃取可分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等。第62页，共106页，2023年，2月20日，星期日10、结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。结晶的方法：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法等。第63页，共106页，2023年，2月20日，星期日11、干燥干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经过干燥后，可以提高酶的稳定性，利于产品保存、运输和使用。常用的干燥方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。第64页，共106页，2023年，2月20日，星期日12、在酶的分离纯化工业中必须注意的问题（1）要注意防止酶变性失活除少数情况外，所有操作必须在低温下进行，特别是有机溶剂存在时更要特别小心；大多数酶在pH＜4或pH＞10的条件下不稳定，故不能过酸过碱；酶溶液常易在表面上形成泡沫而变性，故应防止泡沫的形成；重金属能引起酶失效，有机溶液能使酶变性，微生物污染、蛋白酶能使酶分解，都必须予以防止。第65页，共106页，2023年，2月20日，星期日在酶的分离纯化工业中必须注意的问题（2）酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此在不破坏酶所需的条件下，可使用各种“激烈”的手段，此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性又会发生—定的变化，从而提供了更多可供采用的条件和方法。第66页，共106页，2023年，2月20日，星期日在酶的分离纯化工业中必须注意的问题（3）通过检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供了直接依据。在工作过程中从原材料开始每步都必须检测酶活性，—个好的方法和措施是使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。第67页，共106页，2023年，2月20日，星期日第三节化学修饰酶与化学人工酶一、酶的化学修饰化学修饰：是指通过酶分子的改造以达到结构改性之目的，又称“生物分子工程”。酶分子化学修饰方法种类繁多。根据修饰方法和部位的不同，酶分子的这种体外改造又可分酶的表面修饰和酶的内部修饰。第68页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修饰①化学固定法一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改变。第69页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修饰②酶的小分子修饰用小分子共价修饰酶可使酶稳定性提高。主要是利用些适宜的小分子修饰剂来修饰酶表面的一些基团，如：—COO-、—NH3+、—SH、—OH、咪唑基等。第70页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.酶的表面修饰③酶大分子修饰根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式可分为大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。第71页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.酶的内部修饰①非催化活性基团的修饰经常被修饰的残基可以是亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是亲电子的(Tyr、Typ)，还可以是可氧化的(Tyr、Tpy、Met)。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性态，改变酶对特殊稀薄物的束缚能力。第72页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.酶的内部修饰②酶蛋白主链修饰至今，酶蛋白主链修饰主要是靠酶法。如将ATP酶用胰蛋白酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位分子量变化不大，说明天然酶并非总是处于最佳的催化构象状态。第73页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.酶的内部修饰③催化活性基团的修饰通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的取代，这种将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法叫化学突变法，如Berder等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没有水解能力，但能水解高度活化的底物如硝基苯酯。这种方法由于受到专一性试剂、有机化工业水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基酸能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。第74页，共106页，2023年，2月20日，星期日

二、化学人工酶根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物——人工酶（arti-ficialenzyme）。人工酶的制作有两种：半合成酶和全合成酶。第75页，共106页，2023年，2月20日，星期日

二、化学人工酶1.半合成酶将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质结合，使可形成新的生物催化剂——半合成酶(Semisyhtetieemyme)。①与金属或金属有机物的结合。有的半合成酶是与具有催化活性的金属或金属有机物结合形成的。②与特异性的物质结合。有的半合成酶是与具有特异性的物质相结合而形成的。第76页，共106页，2023年，2月20日，星期日

二、化学人工酶2.全合成酶这类人工酶不是蛋白质，而是有机物，通过加入酶的催化基团与控制空间的构象，像自然酶那样能选择性地催化化学反应，包括小分子有机物(大多为金属络合物)、抗体酶(催化抗体)和人工聚合物酶。①小分子有机物全合成酶。氨肽酶全合成酶、转氨全合成酶、ATP水解全合成酶。②人工聚合物酶。第77页，共106页，2023年，2月20日，星期日第四节固定化酶水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？第78页，共106页，2023年，2月20日，星期日

一、固定化酶的特点优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好；酶反应过程可以加以严格控制；产物中没有酶的残留，简化了工业设备；可以增加产物的得率，提高产物的质量；酶使用效率高，成本降低。第79页，共106页，2023年，2月20日，星期日

一、固定化酶的特点缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，在生产初期投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比，不适于多酶反应；胞内酶必须经过酶的分离过程。第80页，共106页，2023年，2月20日，星期日二、酶的固定化方法酶的固定化方法大致分为：1.物理法（1）吸附法（2）包埋法2.化学法（1）共价偶联法（2）交联法第81页，共106页，2023年，2月20日，星期日共价偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇连续第82页，共106页，2023年，2月20日，星期日第83页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法：通过氢键和π电子亲和力等物理作用，将酶固定在水不溶载体上的方法。常用的载体：无机吸附剂如高岭土、硅藻土、硅胶、磷酸钙胶、微孔玻璃等。有机吸附剂有纤维素、骨胶原、赛璐玢、火棉胶等。第84页，共106页，2023年，2月20日，星期日1.吸附法离子吸附法：离子吸附法是将酶同含有离了交换剂的水不溶性载体相结合。常用载体：①阴离子交换剂，如DEAE(二乙氨基乙基)-纤维素、TEAE(四乙氨基乙基)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；②阳离子交换剂，如CM-纤维素、纤维素-柠檬酸、Amberlite(G-50、IRC-120）等。第85页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.包埋法将聚合物单体和酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定化。此法由于酶分子仅仅是被包埋，未发生化学反应，故酶活力高，但此法不适宜作用于大分子底物。第86页，共106页，2023年，2月20日，星期日2.包埋法包埋方法：

①聚丙烯酰胺凝胶包埋法②辐射包埋法③卡拉胶包埋法④大豆蛋白质包埋法⑤微胶囊法。第87页，共106页，2023年，2月20日，星期日3.共价偶联法是指将酶与聚合物载体以共价键结合的酶的固定方法。酶与载体共价结合的功能基团：①氨基：Lys的ω-NH2和肽链N端的α-NH2；②羧基：Asp的β-羧基、Glu的γ-羧基和C端的α-羧基；③酚基、Tyr的酚环；④巯基：Cys的巯基；⑤羟基：Ser、Thr、Tyr的羟基；⑥咪唑基：His的咪唑基⑦吲哚基：Trp的吲哚基。常见的包括一NH2、一COOH、His的芳香环。第88页，共106页，2023年，2月20日，星期日3.共价偶联法载体直接关系列固定化酶的性质和形成：①亲水性载体在蛋白的结合量、固定化酶的活力和稳定性上都优于疏水载体；②载体需要结构疏松、表面积大，且有一定的机械强度；③带有在温和的条件下可与酶共价结合的功能基团；④最好没有或很少专一性吸附；⑤载体应便宜易得，并能反复使用。一般载体必须先活化。第89页，共106页，2023年，2月20日，星期日4.偶联反应

①重氮化反应：是带芳香氨基常用的载体，载体先用HNO3处理成重氮盐衍生物，然后在温和的条件下与酶蛋白反应。此法常用的载体有：a.多糖类和芳香氨基衍生物；b.氨基酸的共聚物；c.聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯马来酸共聚体与多孔玻璃等。第90页，共106页，2023年，2月20日，星期日4.偶联反应②异硫氰酸酯反应：

含芳香氨基的载体先用硫芥子处理(如光气)制成异硫氰酸的衍生物，得到的产物极易在温和条件下和酶分子起反应，在中性pH值它就与α-NH2起反应。③溴化氢-氨碳酸基反应④芳香烃化反应⑤叠氮反应⑥酸酐反应第91页，共106页，2023年，2月20日，星期日4.偶联反应⑦缩合反应⑧巯基-二巯基交换反应⑨金属偶联反应第92页，共106页，2023年，2月20日，星期日5.交联法利用双/多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶。交联剂根据它们的功能基团的相同或不相同可分为“同型”或‘‘杂型’”两类，前者如戊二醛、苯基二异硫氰；后者如甲苯-2-异氰-4-异硫氰等，其中戊二醛用得最多。交联反应可以发生在酶分子之间，也可以发生在酶分子内部，酶浓度低时发生在酶分子内部，高酶浓度下分子间交联比例上升形成固定化酶后往往为不溶态。第93页，共106页，2023年，2月20日，星期日