ChIP实验精讲(做科研的必看)

Chip实验精讲（做科研的必看）口染色质免疫共沉淀（Chip）□概述ChIP：chromatinimmunoprecipitationassay,染色质免疫沉淀技术。□研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。^珏是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法口□原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP应用口1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系； 2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； 4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。□试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。□②交联的时间很关键。交联的时间一般为2-30分钟。□③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。□④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。□取1直径10cm培养皿的细胞。加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V）,使蛋白和DNA交联。室温下，轻摇10分钟。加入甘氨酸至终浓度为125mM,室温下放置5分钟，以终止交联。□吸去培养基，用冰冷PBS洗细胞2次。□使用细胞刮刀，加入5ml冰冷PBS,刮下细胞，收集至一个50ml离心管中。:□再用3ml冰冷PBS洗培养皿2次，至50ml离心管中。□□4℃，10008，离心5分钟收集细胞。□□吸弃上清，用SDSLysisBuffer重悬沉淀（每1X107个细胞加800口1）。口□SDSLysisBuffer配方：50mMHEPES-KOHpH7.5140mMNaCl1mMEDTApH81%TritonX-1000.1%SodiumDeoxycholate0.1%SDSProteaseInhibitors（每次新鲜加入）□注意事项：使用悬浮细胞实验时，加入0.75%（v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分钟，1000g□离心沉淀细胞。冰冷PBS洗3次，用SDSLysisBuffer重悬细胞（每1X107细胞加800口1）。口组织免疫沉淀样品的制备注意事项：①每个IP反应建议使用肝组织301^,可按实际情况调整。□②每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。□③每个IP反应最适染色质的量为5-15ug。 ④每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。⑤所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂proteininhibiter（cocktail）。2.1.交联反应注意事项：①冰冻组织应置于冰上融化。②冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。③操作过程中要一直在冰上进行，尽量缩短操作时间防止蛋白降解。□将冰冻或新鲜组织切成小块(1-3mm3)。取一个空的15ml离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。每克组织加10mlPBS。加入终溶度1.5%(v/v)的甲醛，室温旋转15分钟。□加入甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应，室温旋转5分钟。□□4°C，720江山，离心5min。□弃上清，用加入10ml预冷的PBS洗涤。4°C，720rpm，离心5min，弃上清。□注意事项：①所得组织可用液氮速冻，保存于-80°C。 ②避免反复冻融。③使用时可用预冷PBS重悬组织，每克组织加10ml，置冰上解冻。□降解组织剪掉1ml枪头的末端，使吸头口增大。用1mlPBS重悬50—100mg组织。□将溶液加入锥形研磨管中，研磨2分钟。用1ml注射器连接18号钝圆针头，插入研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。显微镜下观察细胞悬液，以确定得到的是单细胞悬液。1000rpm,4°^离心10分钟收集细胞。□弃上清，用SDSLysisbuffer重悬沉淀(每1x107个细胞加入800口1)。口超声处理。3.超声3.1超声处理裂解液，将DNA打断成500-1000bp范围内的片段。□注意事项：①使用组织进行实验时，要得到单细胞悬液，需从超声处理开始。②细胞系不同，需要超声的时间也不同，需要分别优化得到最佳条件。□③取部分样本使用1.5%(质量百分比)的琼脂糖凝胶电泳，分析超声结果。□33.2超声处理后，4°C,10,000g，离心10min,以除去细胞碎片。转移上清至新管中。3.3超声后的样本各取50口1,测量DNA浓度，用为PCR对照。□注意事项：①超声后溶液可在液氮中速冻，可于-80°C保存2个月。 ②避免反复冻融,以免样品降解。③超声时间过长会使核小体与DNA的交联断裂，一般超声时间为15min。4.纯化DNA4.1试剂盒纯化DNA口①加入2口1RNA酶A（0.5mg/ml）。②65°C,4—5小时（或过夜），解交联。③按照DNA纯化试剂盒说明书纯化DNA。 ④样本可于-20°C保存。□□注意事项：使用DNA纯化试剂盒纯化DNA时,应加入RNA酶A处理样品,以免RNA浓度过高减少DNA的最终纯化量。□4.2酚:氯仿抽提纯化DNA ①加入5口1蛋白酶K（20mg/m1）。②65°C,4-5小时（或过夜），解交联。 ③等体积酚:氯仿抽提DNA样品3次。④取水相加入10口1糖原（5mg/m1）,2倍体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥10min。□⑤加入100口1水溶解沉淀。 ⑥样本可于-20°C保存。□注意事项：使用蛋白酶K消化样品，可以水解蛋白质，使蛋白质与DNA解交联，以促进DNA的纯化。□4.3DNA浓度测定①取5口1纯化DNA,稀释200倍，测定OD260。□②DNA浓度（口g/m1）=OD260x10,000,计算DNA浓度。5.免疫沉淀口使用超声处理所得溶液进行免疫沉淀反应。建议：①沉淀反应DNA含量约为25Pg。口②每个样本用RIPA缓冲液稀释10倍。□③设一个抗体对照和一个仅加磁珠（不加抗体）的对照。□RIPAbuffer配方：50mMTris-HClpH8150mMNaCl2mMEDTApH81%NP-40口0.5%SodiumDeoxycholate0.1%SDSProteaseInhibitors（每次新鲜加入）样本中均加入一抗（对照样品不加）。注意事项：①先进行预实验得到最佳的抗体加入量。②每25口gDNA一般加入1-10Pg抗体。□样品中加入20口l的proteinA/G磁珠，免疫沉淀（IP）,4°C,缓慢旋转过夜。2000g离心^^收集磁珠，弃上清。□用1ml低盐washbuffer洗涤磁珠3次。2000g离心1分钟。低盐Washbuffer配方：0.1%SDS口1%TritonX-1002mMEDTApH8150mMNaCl20mMTris-HClpH8用高盐washbuffer洗1次。2000g离心1分钟。□高盐washbuffer配方：0.1%SDS口1%TritonX-1002mMEDTApH8500mMNaClmMTris-HClpH8注意事项：①如果背景过高，则应增加洗涤次数。□②超声处理后的染色质先与proteinA/G磁珠共孵育1小时，将消除与磁珠的非特异行结合，降低背景。6.免疫复合物洗涤和解交联6.1回收DNA：向proteinA/G磁珠中加入120PlExtractionbuffer,30°C,旋转15分钟。Extractionbuffer配方：1%SDS口100mMNaHCO32000g离心1分钟。将上清转移至新管中。样本可于-20°C保存。.纯化DNA可用DNA纯化试剂盒或酚:氯仿抽提进行（参照上面步