(33)-3.5.2亲和层析技术简介生物制药工艺学

第二节亲和层析技术简介亲和层析技术是亲和纯化技术当中发展最为成熟的代表性技术，下面我们来学习一下有关亲和层析的相关知识。亲和层析是利用生物中多数大分子物质，具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性，而建立的分离纯化技术。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提取目标物，还可以根据其生物功能，将有活性与无活性的目标物分开，是生物产物分离纯化的常用技术之一。亲和层析具有操作简便，设备简单，适用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和等优点。但亲和吸附剂通用性较差，洗涤条件较苛刻，也成为了他的限制条件。如图所示，亲和层析的设计和过程大致分为三步：首先是配基固定化，选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联或共价结合，生成具有特异性，亲和性的分离介质。然后吸附样品，亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析介质之间没有亲和作用，不能被吸附而被洗涤去除。最后进行样品解析，选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质解析下来。载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供了两物质特性结合的空间环境。理想的载体应符合5个条件，一，载体必须能充分功能化，也就是说，在提要具有足够数量的功能基团或能方便引入多个化学活性基团，2，载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性，尽量减少非专一性吸附，3，载体必须具有高度的水不溶性和亲水性，这是保证被吸附生物分子稳定性的重要因素之一。4，载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。5，理想的亲和层析载体，外观上因为大小均匀的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的疏通性。亲和层析方法中常用的载体包括纤维素，琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，多孔玻璃珠，壳聚糖等。亲和配基是亲和介质的重要组成部分，配基的选用主要取决于分离对象。理想的配基应符合三大要求，第一，配基与配体有足够大的亲和力，一般要求亲和势在10的-4次方到10的-8次方之间。第二，配基与配体的结合应是专一的，这样才能保证分离与纯化的效果。第三，配基应具有化学活性，配基分子上须具有与载体偶联的化学基团，使偶联反应尽可能简便，温和。配基浓度的选择应当适宜，对亲和势比较低的配基，增加配基浓度有利于吸附，当增加配基浓度有困难，而亲和势又较低时，可增加亲和柱的长度来提高吸附率，配基浓度太高，容易使大分子配基上的活性中心相互掩盖，反而使亲和柱吸附力降低。配基浓度太高，也会使吸附力太强，造成洗脱上的困难，另外，随着配基浓度的增加，非专一性吸附也增加，专一性吸附能力降低，理想的配基浓度为1~10微摩每升，并以2微摩每升凝胶为最好。在一般情况下，亲和结合时配体分子与配基分子，仅有一部分发生相互作用，为保证亲和吸附剂有足够大的亲和能力，配基固定化使其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联，制备亲和柱时，应首先选用大分子配基，因为小分子配基可供识别互补的特殊结构较少，一旦偶联到载体上，这种识别的结构更少，不利于亲和结合。配基的类型主要分为特殊配基和通用配基，抗原的抗体，激素的受体，酶的专一抑制剂均属特殊配基，该类配基分离效果好，但性质不稳定，价格昂贵，成本较高。使用通用配基制成的亲和层析介质可用于一类物质的分离提纯，选择性低于特殊配基，但应用范围广泛，使用方便载体活化与偶联为了提高亲和层析的效果，通常希望固定相的配基与流动相的配体，具有较强的亲和力，然而亲和力的大小，受许多因素的影响，下面我们就来看一下，影响亲和力大小的几个条件。首先，配基的浓度对于亲和力的大小有直接影响，对于低亲和力系统为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。其次，配基与载体不适当的偶联引发生分子结构变化，造成空间位阻，有可能影响两物质间原有的亲和力，此时可选择增加载体与配基间的活动度，减小空间位阻。第三，在多肽或蛋白质等大分子作为配基时，必须控制偶联反应条件，以最少的键与载体连接，这样有利于保证亲和吸附剂具有较大的亲和能力。第四，载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响，应选择适宜孔径的载体进行偶联。最后，亲和介质自身的化学微环境对其亲和力也有一定影响。比如低极性基团，会引起非特异性吸附作用，有时会有助于亲和力提高，但有时却有碍于亲和配基与配体的结合。对亲和层析的概念有了基本的认识后，我们来学习一下亲和层析的吸附与洗脱的知识。亲和吸附的强弱，除了与亲和吸附剂及配体的性质密切相关外，还与缓冲液的种类，离子强度，PH，温度和层析流速有关，亲和吸附的具体条件需要摸索，无特定规律可循。为了获取理想的分离效果，层析柱，使用前必须充分平衡，流速尽可能慢。造成亲和吸附能力降低，分离效果变差的主要原因是亲和层析中的非专一性作用。任何具有离子基团的亲和吸附剂，都会影响蛋白质等多聚电解质的洗脱行为，这种相互作用，在亲和层析中产生了非特异性结合。在亲和层析的吸附剂上，还会存在疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，也会形成非专一性吸附。亲和层析的洗脱是指改变条件，使亲和络合物完全解离，从吸附剂上脱落并回收目的物的操作，主要有三种方法：一是非专一性洗脱，最常用的是通过改变洗脱剂的PH，以影响电性基团的解离程度而洗脱。二是特殊洗脱，当一些蛋白质的吸附十分紧密，不能用非专一性方式洗脱时，可用特殊的化学方法裂解配基与载体的连接键，获得配基-蛋白质络合物，再用透析或凝胶过滤，除去配基。三是专一性洗脱，主要采用针对目