chapter3酶的提取与分离纯化12生技

Chapter3酶的提取与分离纯化许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。

机械破碎、物理破碎、

化学破碎、酶解破碎3.2细胞破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理3.3酶的提取溶剂选择：极性物质易溶于极性溶剂；非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中；碱性物质易溶于酸性溶剂中。大部分酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取；有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。提高温度降低溶液粘度增加扩散面积縮短扩散距离增大浓度差等防止酶的变性失活注意控制好温度、pH值等提取条件。3.3酶的提取提高酶分子的扩散速度提高提取效率：酶的主要提取方法提取方法使用溶剂/溶液提取对象盐溶液0.02～0.5mol/L的盐溶液在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液PH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液PH8～12的水溶液在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂可与水混溶的有机溶剂与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶

大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。（1）沉淀分离通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀利用不同蛋白质在不同盐浓度下溶解度不同的特性，在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质析出，实现酶与杂质的分离等电点沉淀利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质析出有机溶剂沉淀利用酶与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出复合沉淀在酶液中加入某些物质，使之与酶形成复合物而沉淀析出选择性变性沉淀选择一定条件使酶液中的杂质变性沉淀，而不影响所需的酶盐析法

蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。低盐浓度下，蛋白质溶解度随盐浓度的升高而增加，即盐溶现象。在盐浓度达到某一界限后，蛋白质溶解度随盐浓度的升高而降低，从而使蛋白质沉淀析出，即盐析现象。S：蛋白质的溶解度(g/L)；

S0：为蛋白质在离子强度为0时（即纯溶剂中）的溶解度(g/L)；I：离子强度；Ks：盐析常数，主要取决于盐的性质，与蛋白质的种类有关，但与温度和pH值无关。酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度的关系：a. 不同种类的盐主要影响Ks；b.离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好(Ks大）。β：主要取决于蛋白质的性质，与温度和pH值有关。当pH和温度值一定时，β为常数。

在一定的温度和pH值条件下，S0为常数，上式可写作：Cohnx公式温度的影响：

一般物质的溶解度随温度的升高而增大； 现在（高离子强度溶液中），升高温度有利于某些蛋白质溶液的失水，因而温度升高，蛋白质的溶解度下降。温度影响的值：T，；T，。较高的盐析效能；高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；溶解度受温度的影响小；盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；不易引起蛋白质的变性；价格低廉；无机盐的挑选原则：

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾等。其中以硫酸铵最为常用。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。硫酸铵缺点：缓冲能力较差，铵离子会干扰蛋白质的测定水解后溶液pH降低，在高pH下产氨，腐蚀性强，有异味，终产物必须除尽。硫酸铵优点：在水中的溶解度大温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，价廉易得。影响因素及控制pH值：蛋白质最低溶解度出现在蛋白的pI处，因此一般将pH值调节到与分离的蛋白质的等电点附近。温度：（1）有机溶剂与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。（搅拌、少量多次加入，避免温度骤然升高）有机溶剂沉淀法温度：（2）温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10C下进行。有机溶剂：通常随有机溶剂浓度的上升，蛋白质溶解度下降。蛋白质：避免使用很稀的浓度，因蛋白质在高浓度下才较稳定。优点：A、蛋白质沉淀的浓度范围较宽，所得产品的纯度较高；B、从沉淀的蛋白质中去除有机溶剂很方便，且有机溶剂本身可作为蛋白质的杀菌剂。缺点：A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难；B、沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性；C、收率比盐析法低；D、试剂易燃，有毒。

有机溶剂沉淀法特点（2）

离心分离根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。沉降速率：蛋白质分子量、分子密度、组成、形状有关。沉降系数：描述沉降性质（与分子密度/分子量成正比）分子颗粒的沉降系数是指单位离心力场颗粒下沉的速度。离心力（RCF）相对离心加速度，指离心加速度a相对重力加速度g的倍数，单位为g。离心力与转速的换算例题：颗粒距离离心机轴的半径是6cm，转速是65000rpm，求颗粒的RCF是多少？

常速离心机（低速离心机）最大转速：<8000rpm相对离心力(RCF)：<

1×104g高速离心机：最大转速：<10,000~25,000rpm相对离心力：1×104～1×105g，

离心机的选择超速离心机：最大转速：25,000rpm相对离心力：5×105g甚至更高。差速离心差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。应用：分离大小和密度相差较大的颗粒。优点：操作简单缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重。3）沉降的颗粒受到挤压。

离心方法的选用密度梯度离心（速度区带离心法）样品在密度梯度介质中进行的离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。特点：(1)区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度；(2)适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。常用的梯度介质：蔗糖、甘油等。防止扩散：适当增大离心力，缩短离心时间。

离心方法的选用等密度梯度离心（沉降平衡离心）根据颗粒的密度不同而进行分离。当欲分离的不同颗粒密度范围在离心介质密度范围内时，在离心力场下，不同浮力密度的颗粒或下沉，或上浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与其密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。

离心方法的选用常用的介质：氯化铯、硫酸铯、溴化铯等。特点：(1)介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度；(2)适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。共同点：都是预先将介质铺成梯度。差异：所依赖的基础、离心时间、转速及颗粒与周围介质的密度是否相等诸方面是有一定差别。速率区带离心和等密度区带离心速度区带离心法等密度离心法沉降速度主要依赖颗粒形状和大小沉降平衡主要依赖颗粒密度，与形状和大小无关离心时间较短，待大颗粒到达管底前停止离心。颗粒沉降速度不为零，若延长离心时间，颗粒会沉管底。离心时间与液柱长短有关（一般16～18小时）。每种颗粒的沉降速度均为零，延长离心时间也不再下沉。转速较高（>50,000rpm)转速较低(<50,000rpm)颗粒密度不等于周围介质密度沉降平衡时，颗粒密度等于周围介质密度层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。层析分离原理：利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。层析分离方法

层析方法分离依据离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离原理：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。活性基团不同：阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。

离子交换层析离子交换剂：含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。分辨率高、分离容量大、易于放大和操作广泛应用于生物化工、制药、环境等领域中，成为分离纯化蛋白质、氨基酸等荷电生物分子的主要手段。生化分离中~75%工艺采用离子交换法。优点离子交换层析蛋白质的带电性(两性化合物)工作液pH改变蛋白质的离子形态生物大分子离子交换机理（蛋白质）pH阳离子pI不带电pH阴离子<<(阳离子交换剂)(阴离子交换剂)阴阳离子交换剂的选择：生物大分子自身等电点，所处分离环境pK——判断离子交换剂的pH使用范围及洗脱剂的选择。如：pH<3,宜选用强酸性介质；pH>10,宜选用强碱性介质。pH应用范围：强性离子交换剂>弱性离子交换剂对于电荷密度较高的物质，为避免造成不可逆吸附，宜采用弱型离子交换剂。离子交换剂的强弱(电离常数pK)阳离子交换剂：pK越小，酸性越强；阴离子交换剂：pK越小，碱性越强又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶层析凝胶过滤原理凝胶像分子筛一样，将大小不同的分子进行分离。大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢；从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离目的

。介质为不带电的惰性物质，不与溶质分子作用——分离条件温和，蛋白质不易变性，收率高，重现性好。工作范围广，可分离分子量范围广。设备简单、易于操作、周期短、每次分离后无需再生即可连续使用。凝胶层析优点

凝胶过滤介质的种类凝胶过滤的骨架：天然多糖类、合成大分子骨架介质优点缺点例子多糖类亲水性好生物大分子相容性允许生物大分子透过而不发生变性多为软介质、压力降大、不易易受微生物侵蚀操作、纤维素、葡聚糖、琼脂糖合成大分子介质刚性强，不易变形不易受微生物侵蚀相容性较差聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯等混合骨架(天然大分子+合成高聚物)增加介质刚性；抗微生物侵染性；与生物大分子相容性较好葡聚糖-聚丙烯酰胺等亲和层析生物亲和作用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性。生物分子间地这种特异性相互作用称为生物亲和作用。亲和作用的本质具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔”的空间结构关系。

蛋白质的结合部位及各种结合作用力亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合：

静电作用氢键疏水相互作用配位键弱共价键亲和层析的四个要素1.离子强度提高离子强度会降低或消除静电引力、氢键作用，增大疏水相互作用等。亲和作用的影响因素3.抑制氢键形成的物质

脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成。2.pH如果静电引力对亲和结合作用的贡献较大，则pH将严重影响亲和作用。在亲和分离操作中，溶液pH值的选择非常重要。4.温度温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏水性相互作用增强。5.离液离子SCN－，I－和ClO4－等离液阴离子可减弱水分子之间相互作用，使分子间疏水相互作用降低。6.螯合剂如果亲和结合作用源于亲和分子对与金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸(EDTA)等鳌合剂除去金属离子，可使亲和结合作用消失。亲和作用的影响因素亲和层析优点①选择性高、特异性极强②操作条件温和③回收率高亲和层析优缺点①普遍性、通用性不够②费用高39亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度的选择性，因此，亲和层析操作与一般的固定床吸附操作方式相同，多采用断通式前端分析法。亲和层析原理与操作401.酶的抑制剂2.抗体利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和色谱。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012L/mol。因此，免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。3.A蛋白4.凝集素5.辅酶和磷酸腺苷6.三嗪类色素7.过渡金属离子

亲和层析介质416.三嗪类色素7.过渡金属离子8.肝素

亲和层析介质9.组氨酸组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。亲和层析洗脱方法（1）特异性洗脱法利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。

特点：洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性。由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。

（2）非特异性洗脱法

非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。Chapter3

3.6双水相分离形成原因：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。向水相中加入溶于水的高分子化合物，可以形成密度不同的两相（或多相），轻相富含某一种高分子化合物；重相富含盐类或另一种高分子化合物。因两相均含有较多的水，所以称之为双水相。3.6.1双水相萃取双水相萃取的原理生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即分配系数不同。一、双水相分离理论二、双水相萃取相图（ATPS）系线：连接双节线上两点的直线。杠杆规则：在同一条系线上的各点分成的两相组成相同，体积比不同。其体积比服从杠杆规则：双节线：双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。双节线系线两相区均相区二、双水相萃取相图（ATPS）性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大；反之则越小。临界点：系线长度趋于零时,两相差别消失，溶质在两相中的分配系数均为1(K点)，成为单相体系。双节线系线两相区均相区三、物质在两相中的分配与溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示：CT、CB：分别代表上相、下相中溶质的浓度。K：与体系温度、压力及溶质和溶剂的性质有关，与溶质浓度无关。影响分配平衡的参数：（1）成相聚合物的分子量和浓度（2）体系pH（3）体系中盐的种类和浓度（4）体系温度A)成相聚合物分子量的影响PEG/Dextran双水相体系：生物分子分配于富含PEG的上相分配系数PEG相对分子质量生物分子分配于富含Dextran的下相Dextran相对分子质量分配系数（1）成相聚合物的分子量和浓度A)成相聚合物分子量的影响希望上相获得较高的蛋白质收率，降低PEG聚合物的平均分子量。若希望在下相获得较高的蛋白质收率，则应增加PEG聚合物的平均分子量。PEG/Dextran双水相体系：B)成相聚合物的浓度随着成相聚合物（聚合物/盐混合物）的总浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质(疏水性等)差别增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1)，即大于1或小于1。因此，成相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。①盐的种类

在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子（蛋白质、核酸）分别向两相移动分配。(2)盐的种类和浓度盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。②盐的浓度例如，PEG/磷酸盐体系PEG、磷酸盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。影响蛋白质的表面疏水性，扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同。利用这一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。(3)体系pH值的影响pH影响蛋白质中可解离基团的离解度，从而改变蛋白质所带电荷和分配系数。pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，影响H2PO4-和HPO42-之间的比例，影响相间电位差U2-U1，从而影响分系数。pH微小的变化，有时会使蛋白质的分配系数发生巨大的改变（改变2~3个数量级）。分配系数对温度的变化不敏感成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，且室温时粘度较冷却时(4℃)低，有助于相的分离并节省了能源开支。(4)温度的影响四、双水相萃取技术的应用主要应用于胞内酶的提取和精制传统胞内酶的提取：细胞破碎、离心去除细胞碎片、提取。存在问题：能耗大；细胞碎片尺寸变化，固-液分离困难；产品活性和功能对pH值、温度和离子强度等敏感；大部分蛋白质亲水性强，在有机溶剂中溶解度低，且易变性，传统的溶剂萃取法不适合。（一）目的物的萃取双水相萃取的工艺（二）PEG的循环（三）无机盐的循环（一）目的物的萃取1、若目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取：把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相含目标产物。两步双水相萃取工艺两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标。三步双水相萃取酶的流程示意图2、若细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。（一）目的物的萃取（二）PEG循环在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有三种方法：①加入盐使目标产物转入富盐相，从而回收PEG②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。③超滤（三）无机盐的循环方法一将含磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集。方法二电渗析、膜分离回收盐类。α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6；蛋白酶的收率高于60%，蛋白酶的分离系数高达15.1，比活率为原发酵液的1.5倍。α-淀粉酶发酵液PEG/(NH4)2SO4

双水相体系一次萃取：提取α-淀粉酶、蛋白酶萃取条件：PEG1000(15%)(NH4)2SO4(20%)pH=8应用实例1：分离和提纯各种蛋白质(酶）3.6.2反胶团萃取(1)反胶团萃取特点（1）萃取率和反萃取率高，且