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文档简介

植物总RNA的提取及RT-PCR生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1.学习从植物组织中提取总RNA的方法

2.了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1.RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2.RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一)仪器及器皿

1．低温离心机；2．琼脂糖凝胶电泳系统；3．高压灭菌锅；

4.PCR仪；5．研钵；6.一次性手套等；

7.离心管；8.培养皿；9.烧杯及试剂瓶等。

(二)药品

1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.异硫氰酸胍(GT)3.醋酸钠(NaAc)

4.苯酚5.异丙醇6.氯仿

7.乙醇8.β－巯基乙醇9.琼脂糖

10.MLV反转录试剂盒11.TaqDNA聚合酶12.引物

(三)试剂配制

1．0.1%DEPC水灭菌

2.4mol/L异硫氰酸胍

3.2mol/LNaAc（pH4.8）灭菌

4.3mol/LNaAc（pH4.8）灭菌

5.4mol/LLiCl灭菌

6.1TE缓冲液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）,灭菌。

四、实验步骤

（一）总RNA的提取

（1）研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2g植物材料，充分研磨后转入一个含有300

l的4MGT的1.5ml的聚丙烯管中，摇匀

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