蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化

蛋白质与酶工程酶的提取、分离和纯化检验医学院张雪梅现在是1页\一共有85页\编辑于星期五一、概述二、酶的提取三、酶的分离纯化四、酶的结晶五、浓缩与干燥六、酶纯化步骤的设计及评价酶的提取、分离和纯化现在是2页\一共有85页\编辑于星期五一、概述1-1酶提取与分离纯化的定义

将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与其它物质分开，从而获得所需酶的技术过程*酶的纯化程度根据需要而定*纯化方法多种多样，为获得较好的效果往往是2种或2种以上联合应用

现在是3页\一共有85页\编辑于星期五1-2提取纯化之目的1)酶催化功能的应用2)酶学研究

酶的结构、功能、催化机制、催化动力学酶的生物合成及其调控规律等

1-3纯化的必要性1)生物细胞中同时存在多种多样的酶2)多酶可能作用于同一个底物3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的现在是4页\一共有85页\编辑于星期五二、酶的提取（extraction)2-1了解所分离酶在细胞中的分布

1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到2、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性

现在是5页\一共有85页\编辑于星期五真核细胞内酶的分布①细胞膜：ATP酶、腺苷酸环化酶等②细胞核：DNA聚合酶、连接酶和RNA聚合酶等③线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶⑤溶酶体：各种水解酶等⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶类、与暗反应有关的酶系现在是6页\一共有85页\编辑于星期五线粒体主要酶的分布（约有120种酶）部位酶的名称外膜单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-细胞色素C还原酶、脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：单胺氧化酶膜间隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亚硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶内膜细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、肉碱酰基转移酶、-羟丁酸和-羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体特征酶：细胞色素（c）氧化酶基质柠檬酸合成酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸酶、谷氨酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶复合体、天冬氨酸氨基转移酶、蛋白质和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：苹果酸脱氢酶现在是7页\一共有85页\编辑于星期五2-2起始材料的选择

原则：选取酶含量高的材料可以是天然的动植物

或人工培养的微生物、动植物细胞等

*注意材料的生长阶段*注意酶在生物体内的富集区域由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂现在是8页\一共有85页\编辑于星期五2-3细胞膜和细胞壁的破碎1、主要方法：现在是9页\一共有85页\编辑于星期五1）现在是10页\一共有85页\编辑于星期五现在是11页\一共有85页\编辑于星期五2）现在是12页\一共有85页\编辑于星期五现在是13页\一共有85页\编辑于星期五超声波破碎法现在是14页\一共有85页\编辑于星期五3）现在是15页\一共有85页\编辑于星期五4）现在是16页\一共有85页\编辑于星期五2、选择原则如酶法+超声现在是17页\一共有85页\编辑于星期五

2-4酶的提取

1、定义

在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料，使酶充分溶于其中的过程。

2、提取液的选择

根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液

*极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶*酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。现在是18页\一共有85页\编辑于星期五2-4酶的提取3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶液进行抽提4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂肪或磷脂膜分离；高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解析下来。现在是19页\一共有85页\编辑于星期五2-5主要的提取方法1、盐溶液提取该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取常用的盐浓度：0.02-0.05mol/L，大多数P酶用该法提取

R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。

*盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高而增加的现象

*盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐浓度升高而降低的现象现在是20页\一共有85页\编辑于星期五2、酸溶液提取

在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液3、碱溶液提取在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用如：大肠埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液现在是21页\一共有85页\编辑于星期五

4、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂（乙醇、丙酮、丁醇等），如：

P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果

R酶：可用酸苯酚溶液提取现在是22页\一共有85页\编辑于星期五主要的提取方法小结地现在是23页\一共有85页\编辑于星期五5、影响酶提取的其它重要因素温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子的扩散速度；过高则引起酶失活pH:

在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高溶解度，要避开酶的等电点;但是，也不宜偏离pI太远（过高或过低），以免引起酶变性失活现在是24页\一共有85页\编辑于星期五提取液体积

*适当增加其体积，可以提高酶的产率*过量，则降低[酶]，增加后续分离纯化的难度一般为原始材料的3-5倍，且分3次使用

加入保护剂，以提高酶的稳定性如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂现在是25页\一共有85页\编辑于星期五三、酶的分离纯化

（isolation,separation)(purification)3-1分离纯化方法分类1、基于分子大小或质量

(1)离心(2)透析(3)凝胶过滤(4)超过滤2、基于电荷

(1)离子交换色谱(2)电泳(3)等电聚焦现在是26页\一共有85页\编辑于星期五3、基于溶解度

改变pH、离子强度、介电常数等实现的沉淀分离：

(1)盐析法(2)复合沉淀法(3)有机溶剂沉淀法(4)等电点沉淀法(5)选择性变性沉淀法现在是27页\一共有85页\编辑于星期五4、基于特异性结合位置/亲和力的差异

亲和色谱（层析）5、其它方法（略）（1）基于分配系数的差异：双水相系统萃取法（2）基于疏水作用的差异：疏水层析（3）在磷酸钙凝胶柱上分级吸附（4）羟基磷灰石色谱（5）冷冻干燥（浓缩）现在是28页\一共有85页\编辑于星期五1、沉淀分离3-2常用的分离纯化方法现在是29页\一共有85页\编辑于星期五取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为20％

↓4℃，10min离心(3000rpm),10min，弃沉淀上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50％。

↓置4℃，3小时以上离心(3000rpm),10min，弃上清所得沉淀物以0.02MPH7.4PBS溶解至5ml↓装入透析袋中对PBS充分透析（换液3次）

↓萘氏试剂测透析外液无黄色

取少许透析袋液适当倍数稀释后，测蛋白含量。例盐析纯化血清免疫球蛋白现在是30页\一共有85页\编辑于星期五2、离心（centrifugation)（1）定义：利用离心机旋转产生的离心力，使不同大小、不同密度的颗粒分离的技术过程。*优点：处理量大，可达几升*离心条件的选择：以靶酶与杂质的颗粒大小、密度和特性的差异为依据，选择适当的离心机、离心方法和离心条件现在是31页\一共有85页\编辑于星期五常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶结晶分离；高速离心机：最大转速1~2.5x104rpm。在酶的分离中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；为防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速冷冻离心机；超速离心机：最大转速达2.5~12x104rpm。主要用于DNA、RNA（酶）、蛋白质(酶）等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化等。（2）离心机的常用分类现在是32页\一共有85页\编辑于星期五现在是33页\一共有85页\编辑于星期五现在是34页\一共有85页\编辑于星期五

①差速离心（differentialcentrifugation)：即采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离。主要用于分离那些差异大的颗粒；操作简单、方便，但是分离效果较差，一般用于粗分。（3）离心方法的选择现在是35页\一共有85页\编辑于星期五

差速离心举例沉淀：细胞核上清液沉淀：线粒体溶酶体细胞膜碎片上清液沉淀：核糖核蛋白体上清液：可溶性成分500g,10min已经破碎的细胞10,000g,10min100,000g,3h现在是36页\一共有85页\编辑于星期五

②密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力场的作用，使样品中的组份依据其沉降速率和密度的不同而分层、分离这类分离又分为：

差速-区带（Rate—Zonal，R-Z）等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度离心现在是37页\一共有85页\编辑于星期五A.差速-区带(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度液中沉降速度的不同，在离心力作用下处于不同密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分离的目的。

方法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），待分离的样品以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个分别含不同组份颗粒的区带。现在是38页\一共有85页\编辑于星期五B.平衡密度梯度离心法（equilibriumdensitygradientcentrifigation)/等密度梯度离心法当欲分离的不同颗粒的

密度不同时，配制包含其密度范围的离心介质，在离心力作用下，不同浮力密度的颗粒或沉降、或上浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带，从而实现分离目的

常用介质：铯盐（氯化铯，硫酸铯，溴化铯等）现在是39页\一共有85页\编辑于星期五

（4）注意离心温度和介质pH的影响，以免目的酶凝集、变性和失活，甚至引起转子和离心机其它部件的腐蚀。

*一般4℃左右，耐热酶除外*必须是酶稳定的范围内，必要时采用缓冲液现在是40页\一共有85页\编辑于星期五3、过滤与膜分离现在是41页\一共有85页\编辑于星期五现在是42页\一共有85页\编辑于星期五现在是43页\一共有85页\编辑于星期五（1）透析

透析（dialysis)：利用小分子物质的扩散作用，使小分子不断透过半透膜而扩散到膜外，而大分子则被截留于膜内，从而实现分离。用途：去除酶液中无机盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂缺点：耗时；透析结束后，样品体积大，浓度低，难于工业化生产

透析膜是带有微孔的筛子，其孔径在一定范围内是可选的；可用动物膜、羊皮纸、火棉胶等制成。现在是44页\一共有85页\编辑于星期五定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差作用下，小于孔径的颗粒穿过膜孔，而大于孔径者被截留。超滤膜截留的颗粒直径为2--200nm，相等于分子量1x103-5x105，主要用于病毒和各种生物大分子的分离。（2）超滤（ultrafiltration)

现在是45页\一共有85页\编辑于星期五

超滤技术的优势：是纯物理过程，不会改变产品的理化性能和活性与离心和层析法比，处理量大，时间短，易线性放大，成本较低收集细胞效果优良，处理量大，保持细胞活性良好，操作简单可以进行多种工艺的处理，如：细胞、菌体收集、破碎后的澄清过滤、分离、浓缩、缓冲液更换等投资小，通用性强现在是46页\一共有85页\编辑于星期五超滤技术应用：

浓缩和透析除热源脱盐和缓冲液交换小分子处理细胞收集/澄清病毒收集/澄清现在是47页\一共有85页\编辑于星期五4、色谱法（层析法）现在是48页\一共有85页\编辑于星期五（1）离子交换色谱（层析）定义：

IonExchangeChromatography：以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。使用规模可大可小；纯化倍数为10左右现在是49页\一共有85页\编辑于星期五离子交换剂分类

①按其活性基团的不同来分

*阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解离出氢离子（H+)与其它阳离子进行交换，故称（如：

*阴离子交换剂：其活性基团为碱性基团（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定条件下可解离出OH-与其它阴离子交换。如：现在是50页\一共有85页\编辑于星期五

②按母体的种类分：母体（基质）一般是不溶性聚合物，如树脂、纤维素、葡聚糖、醇脂糖等

*离子交换纤维素:是纤维素作为母体，交换容量大（0.2-1.0mg/克干胶）*离子交换树脂:聚苯乙烯树脂为母体*离子交换凝胶:葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，交换容量更大2.5-4.5mg/克干胶）现在是51页\一共有85页\编辑于星期五离子交换层析的基本步骤现在是52页\一共有85页\编辑于星期五解吸方法--洗脱原理

蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交换剂之间的离子键）的常用方法：

①加大反离子的浓度，常用的反离子是NaCl

②改变溶液的pH

（改变结合基团的电荷）

③同时改变pH与离子强度现在是53页\一共有85页\编辑于星期五分离酶蛋白时交换剂选择的一般原则：

根据酶稳定性的需要：

*酶蛋白稳定存在的pH<pI，用阳离子交换剂*酶蛋白稳定存在的pH>pI，用阴离子交换剂*两种pH条件下均能稳定存在，二种交换剂均可现在是54页\一共有85页\编辑于星期五

也称凝胶层析、凝胶过滤或分子排阻层析：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含有各种组份的相对分子量不同而达到分离的一种层析技术

20世纪50年代末发展起来的快速简便的分离技术—操作简便，不需要再生处理即可反复使用，适用于分子量不同的各种物质的分离（2）分子筛层析现在是55页\一共有85页\编辑于星期五原理：

其分离是因为不同大小的分子或进入或不进入凝胶微孔，因而所经过的路程不同、走过柱全长所需的时间各异，实现彼此分离的目的：能进入微孔的小分子不断地进出于一个个凝胶颗粒的微孔，做无定向的分子扩散运动（布朗运动），因而其向下移动的速度就很慢；不能进入微孔的大分子则只能分布于凝胶颗粒的间隙，随溶液流动而进行垂直向下的移动，以较快的速度通过凝胶柱。现在是56页\一共有85页\编辑于星期五现在是57页\一共有85页\编辑于星期五凝胶材料种类层析用的微孔凝胶是凝胶材料与交联剂交联聚合而成的；凝胶内部具有微细的、多孔网状结构。*常用的交联剂：环氧氯丙烷*常用的凝胶材料：葡聚糖凝胶（SephadexG）交联丙烯基葡聚糖（Sephacryl）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelP）琼脂糖凝胶（Sepharose)

*新型凝胶材料：superose，superdex

*分离性能：凝胶孔径大小决定其能够分离的颗粒的大小；凝胶颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。

现在是58页\一共有85页\编辑于星期五相对分子量不是唯一的分离依据；

对于分子量相同的分子，也可依据其分子形状的不同，再加上各种物质与凝胶之间的非特异性吸附作用的差异，也可以分离。现在是59页\一共有85页\编辑于星期五分子筛层析的优缺点现在是60页\一共有85页\编辑于星期五（3）亲和色谱(层析）（1）定义：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，分离纯化生物分子的技术，是酶分离纯化的重要技术

专一而可逆的结合包括：酶蛋白与底物、竞争性抑制物和辅助因子酶蛋白（抗原）与抗体酶RNA与互补的RNA现在是61页\一共有85页\编辑于星期五

（2）原理：

酶的底物或竞争性抑制剂等通过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体；当含酶混合物通过亲和载体时，靶酶便与底物或竞争性抑制剂发生特异性结合，保留在柱子上，其它酶和杂蛋白则因“无处可依”而被洗出柱子

最后通过解吸附，将酶洗脱：

*通过加入底物与亲和载体竞争酶分子*也可改变pH或离子强度使结合的酶解吸现在是62页\一共有85页\编辑于星期五（3）特点①因其结合的专一性，所以产品的纯度高②步骤少③亲和载体的制备较难④造价高、规模小现在是63页\一共有85页\编辑于星期五四、酶的结晶4-1定义：溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，是酶分离纯化的手段之一

时间可以从几小时，几天，几个月，甚至几年。为获得较高纯度的酶创造了条件。为酶结构和功能的研究提供了适宜的样品；

现在是64页\一共有85页\编辑于星期五Artorscience？现在是65页\一共有85页\编辑于星期五1、盐析结晶法：在适当的温度和pH条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程;多用硫酸铵，也用硫酸钠等4-2结晶方法现在是66页\一共有85页\编辑于星期五

通过汽相扩散的方式增加盐浓度，使蛋白析出结晶。使用的试剂盒为商品化的HamptonResearchCrystalScreenI&II和PEGScreen筛选试剂盒进行，分别采用悬滴法和坐滴法。SP0987、SPD0280蛋白质的结晶SP0987在0.2M柠檬酸锂、20%PEG3350条件晶体质量较好SPD0280在0.2M硫酸镁、20%PEG3350条件下晶体质量较好现在是67页\一共有85页\编辑于星期五图3SPD0280蛋白质母体晶体图4SPD0280蛋白质硒代晶体

图1SP0987蛋白质母体晶体图2SP0987蛋白质硒代晶体

现在是68页\一共有85页\编辑于星期五2、有机溶剂结晶法：是在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低而析出酶晶体的过程；常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、甲醇等3、透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐渐达到饱和态而析出结晶的过程4、等电点结晶法：是通过缓慢改变酶液的pH，使之逐渐达到其等电点，而使酶析出结晶的过程现在是69页\一共有85页\编辑于星期五

五、酶的浓缩与干燥

浓缩（concentration)与干燥（Drying)都是酶与溶剂（通常是水）分离的技术过程，是酶分离纯化的一个重要环节1、浓缩：是从低浓度溶液中除去水分或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程

蒸发浓缩，即通过加热或减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，得以浓缩：真空蒸发器、薄膜蒸发器真空蒸发器薄膜蒸发器现在是70页\一共有85页\编辑于星期五2、干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分或其它溶剂除去一部分，获得含水较少的固体物质的过程干燥时，首先是从其表面蒸发，随后才是其内部的水分子扩散到表面继续蒸发。干燥后的物质稳定性好，利于保存、运输和使用

常用的方法：真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥等

获得的酶质量最高的是冷冻干燥现在是71页\一共有85页\编辑于星期五3、酶的保存

在合适的条件下，酶一般可保存较长的时间。在4℃下，可将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存，10mg/ml的浓酶液可加入25%～50%甘油保存可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用需还原性巯基维持催化活性的酶，可与1mmol.L-1EDTA和还原性巯基试剂一起在液氮中保存许多酶在冰冻状态下保存得很好现在是72页\一共有85页\编辑于星期五1、防止酶变性失活：（1）低温（2）一般在中性pH环境操作（pH<4或>10不稳定）（3）防重金属,有机溶剂,微生物及蛋白酶污染2、追踪酶分离每一步的总活力和比活力，评判每个步骤的可行性。6-1酶分离纯化的基本原则六、酶纯化步骤的设计及评价现在是73页\一共有85页\编辑于星期五6-2选择纯化方法时注意事项1、样品体积、酶和杂质的量、pH及离子强度2、酶的物理化学性质：大小、等电点、溶解度、亲水性3、需要纯化的酶的生物学性质：稳定性、辅助因子现在是74页\一共有85页\编辑于星期五6-3分离方法的顺序选择样品量由大到小分辨率由低到高酶的回收率由低到高预处理-→粗分-→细分-→酶的制品现在是75页\一共有85页\编辑于星期五粗分：初步纯化细分1细分2检查纯化的进展情况有机溶剂、硫酸铵沉淀、磷酸钙分级吸附、超滤等离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、聚焦层析等SDS电泳、等电聚焦现在是76页\一共有85页\编辑于星期五6-4纯化步骤的定量评价测定试样中酶的活力和蛋白质浓度计算比活力制作纯化表酶单位/mg蛋白质现在是77页\一共有85页\编辑于星期五酶活性及比活性测定酶的活性是指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度。酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、μg、μmol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。

酶活性测定的目的：反映组织、体液或提纯溶液中酶的存在与多寡（含量鉴定）。现在是78页\一共有85页\编辑于星期五国际单位(IU)在特定的条件下，每分钟催化