蛋白质的共价结构

蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。现在是1页\一共有106页\编辑于星期五一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成和分类１、元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物

现在是2页\一共有106页\编辑于星期五现在是3页\一共有106页\编辑于星期五２、蛋白质的含氮量蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16%蛋白质含量=每克样品中含氮的克数6.25凯氏定氮法现在是4页\一共有106页\编辑于星期五三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白质的4.16倍。现在是5页\一共有106页\编辑于星期五３、蛋白质的分类（1）、依据外形分类球状蛋白质：globularprotein

外形接近球形或椭圆形，溶解性较好纤维状蛋白质：fibrousprotein形似纤维或细棒，分可溶性/不溶性两种膜蛋白质：membraneprotein

亲水性残基少于胞质蛋白现在是6页\一共有106页\编辑于星期五（2）、依据蛋白质的组成分类单纯蛋白

simpleprotein

单纯蛋白，仅由氨基酸组成缀合蛋白

conjugatedprotein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成现在是7页\一共有106页\编辑于星期五单

纯

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱鱼精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中，分为角/胶原/弹性/和丝蛋白等现在是8页\一共有106页\编辑于星期五缀

合

蛋

白糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸磷蛋白：含与Ser,Thr和Tyr残基的羟基酯化的磷酸基。金属蛋白：含有金属离子的蛋白质血红素蛋白：金属蛋白的一个亚类；辅基为血红素，是卟啉化合物。黄素蛋白：含黄素，辅基为FMN和FAD。现在是9页\一共有106页\编辑于星期五（3）蛋白质按生物学功能分类酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等调节因子：如胰岛素、促生长素、促甲状腺素等转运蛋白：如血红蛋白、血清清蛋白、和葡糖转运蛋白贮存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白收缩和游动蛋白：肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白结构蛋白：角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：如胰岛素受体底物-1、A激酶锚定蛋白和信号传递转录激活剂保护和开发蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等异常蛋白：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白现在是10页\一共有106页\编辑于星期五（二）、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。现在是11页\一共有106页\编辑于星期五人为规定Pr分子量上下限下限一般认为从胰岛素开始，其相对分子量为5700（51个氨基酸残基）某些Pr由两至多个亚基经非共价结合而成（寡聚蛋白）分子量高达数百/千万。如谷酰胺合成酶（12个亚基组成），如烟草花叶病毒（2130个亚基和一条RNA链构成。现在是12页\一共有106页\编辑于星期五蛋白质与多肽无严格的界线——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500对于不含辅基的单纯蛋白质，相对分子量/110≈aa残基数20种aa的平均分子量约为138，较小的氨基酸占优势，因此平均分子质量为128。形成一个肽键失去一分子水（分子量18），aa残基的平均分子量为110。100个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为多少？现在是13页\一共有106页\编辑于星期五（三）、蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结构层次一级结构二级结构三级结构四级结构高级结构空间构象现在是14页\一共有106页\编辑于星期五蛋白质的各级结构的基本概念一级（1o）结构：肽链中的氨基酸排列顺序。二级（2o）结构：多肽链借助氢键排列成自己特有的a螺旋和b折叠股片段。三级（3o）结构：多肽链借助各种非共价键（非共价力）弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级（4o）结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于1o结构即多肽链的氨基酸序列中现在是15页\一共有106页\编辑于星期五示例现在是16页\一共有106页\编辑于星期五现在是17页\一共有106页\编辑于星期五肌红蛋白的三级结构和丙酮磷酸异构酶的三级结构现在是18页\一共有106页\编辑于星期五血红蛋白四级结构现在是19页\一共有106页\编辑于星期五（四）、蛋白质功能的多样性1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能现在是20页\一共有106页\编辑于星期五现在是21页\一共有106页\编辑于星期五生老病死，万物轮回(蛋白质层次)生（诞生、生长）：在酶催化下老细胞计划性凋亡和新细胞的再生（新陈代谢）、活细胞的代谢老？蛋白质功能普遍衰退(?)病—个别蛋白质的功能障碍死？蛋白质功能的全部停止/分解

蛋白质——生物功能分子现在是22页\一共有106页\编辑于星期五单细胞生物胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、膜蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（遗传）现在是23页\一共有106页\编辑于星期五多细胞动物个体层次毛发、皮肤-角蛋白骨骼、牙齿-钙+胶原蛋白肌肉-肌球蛋白/肌丝蛋白现在是24页\一共有106页\编辑于星期五二、肽（peptide）AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。现在是25页\一共有106页\编辑于星期五现在是26页\一共有106页\编辑于星期五由两个AA组成的肽称为二肽。含几个至十几个AA的肽链称为寡肽由20个AA以上组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。现在是27页\一共有106页\编辑于星期五多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序含游离-氨基的一端：氨基端或N-端含游离-羧基的一端：羧基端或C-端AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln反过来写的是一个不同的肽现在是28页\一共有106页\编辑于星期五肽键是aa间的基本连接方式。证据：１、Pr中游离α－氨基和α－羧基很少。２、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。３、Pr能发生双缩脲反应（紫红色或蓝紫色）４、人工合成的多聚aa的Ｘ－射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。５、我国首次人工合成－结晶牛胰岛素。现在是29页\一共有106页\编辑于星期五（一）、肽和肽键的结构肽键的特点是：——N上孤对电子与羰基有明显的共轭作用。现在是30页\一共有106页\编辑于星期五①肽键中C-N键有部分双键性质——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式结构存在现在是31页\一共有106页\编辑于星期五共价主链

现在是32页\一共有106页\编辑于星期五（二）、肽的物理化学性质离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小。酸碱性质取决于：—α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离等电点，静电荷为零时溶液的pH值。肽的化学反应也和AA一样，游离的α-羧基、α-氨基、侧链基团可以发生类似AA的反应，如茚三酮反应。具有双缩脲反应—肽特有的反应。（紫红色或蓝紫色）现在是33页\一共有106页\编辑于星期五（三）、天然存在的活性肽生物体中多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位；有许多分子量比较小的寡（多）肽以游离状态存在，这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、谷胱甘肽、蛇毒多肽等现在是34页\一共有106页\编辑于星期五

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽Leu-脑啡肽现在是35页\一共有106页\编辑于星期五

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短杆菌肽S(环十肽)

由细菌分泌，含有D-AA和一些不常见AA，如鸟氨酸（Ornithine,Orn）。

现在是36页\一共有106页\编辑于星期五鹅膏覃碱是一种环状八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制剂（能与RNA聚合酶紧紧结合）现在是37页\一共有106页\编辑于星期五现在是38页\一共有106页\编辑于星期五三、蛋白质一级结构的测定蛋白质AA顺序测定是蛋白质化学研究的基础1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构现已有成千上万种不同蛋白质的一级结构被测定。

什么是Pr的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。现在是39页\一共有106页\编辑于星期五现在是40页\一共有106页\编辑于星期五1.样品必需纯（>97%以上）2.知道蛋白质的分子量3.知道蛋白质由几个亚基组成4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量蛋白质测序前提现在是41页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定现在是42页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略(2)

多肽链的拆分蛋白质一级结构的测定现在是43页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定现在是44页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略(3)

断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。蛋白质一级结构的测定现在是45页\一共有106页\编辑于星期五现在是46页\一共有106页\编辑于星期五巯基（-SH）的保护现在是47页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略蛋白质一级结构的测定(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成现在是48页\一共有106页\编辑于星期五现在是49页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋白质一级结构的测定现在是50页\一共有106页\编辑于星期五（一）、蛋白质测序策略(7)测定每个肽段的氨基酸顺序蛋白质一级结构的测定(8)确定肽段在多肽链中的次序利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。现在是51页\一共有106页\编辑于星期五(9)确定原多肽链中二硫键的位置。（一）、蛋白质测序策略蛋白质一级结构的测定胃蛋白酶水解现在是52页\一共有106页\编辑于星期五两类多肽链末端氨基酸残基：N-端氨基酸C-端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定现在是53页\一共有106页\编辑于星期五Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件二硝基苯衍生物黄色现在是54页\一共有106页\编辑于星期五二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N碱性条件(DNS-aa)现在是55页\一共有106页\编辑于星期五苯异硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N现在是56页\一共有106页\编辑于星期五—N=C=S+N—CH—CO—NH—C·······HHR1PITC—N—C—N—CH—CO—NH—C·······HHRSPTC-多肽—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITCR2多肽+N—CH—CO—NH—C·······HHR2R3少一个氨基酸的多肽现在是57页\一共有106页\编辑于星期五肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线蛋白质N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶—水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N现在是58页\一共有106页\编辑于星期五氨基酸酰肼可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质。上清中的氨基酸可通过其他方法鉴定①肼解法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C1～n-1现在是59页\一共有106页\编辑于星期五（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C

C末端AAα氨基醇水解肽链，鉴定α氨基醇②还原法硼氢化锂现在是60页\一共有106页\编辑于星期五肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量蛋白质C-末端残基顺序。四种羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键∽Y：可作用于任何一个C-末端残基的肽键③羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C现在是61页\一共有106页\编辑于星期五（三）、二硫键的断裂盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。现在是62页\一共有106页\编辑于星期五1、酸水解常用6M盐酸或4M硫酸优点：水解产物不消旋缺点：Trp被沸酸完全破坏含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解Asn、Gln酰胺基被水解（四）、氨基酸组成的分析现在是63页\一共有106页\编辑于星期五2、碱水解一般用5M氢氧化钠缺点：许多AA受到不同程度的破坏部分水解产物发生消旋化优点：Trp不受破坏（四）、氨基酸组成的分析现在是64页\一共有106页\编辑于星期五1、酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化目前序列分析方法最长只能几十个残基，因此需要裂解多肽，然后分离纯化。现在是65页\一共有106页\编辑于星期五R1=Lys（K）或Arg（R）专一性较强，水解速度快R2=Pro（抑制）肽链水解位点胰蛋白酶trypsin减少断裂点：保护Lys侧链ε-NH2或修饰Arg胍基增加断裂点：将Cys变为类似Lys的结构现在是66页\一共有106页\编辑于星期五R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽链水解位点糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻AA性质有关:酸性：-/碱性：+现在是67页\一共有106页\编辑于星期五R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快肽链水解位点R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜热菌蛋白酶（thermolysin)现在是68页\一共有106页\编辑于星期五R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快R1=Pro（抑制）pH2肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin现在是69页\一共有106页\编辑于星期五肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶现在是70页\一共有106页\编辑于星期五2、化学裂解法①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化多肽链的选择性降解现在是71页\一共有106页\编辑于星期五

②NH2OH断裂：较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂

现在是72页\一共有106页\编辑于星期五3、肽段的分离纯化：

凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法现在是73页\一共有106页\编辑于星期五N-端分析法

特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的测定（苯异硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。现在是74页\一共有106页\编辑于星期五无水氨基非质子化PITCPTC-肽现在是75页\一共有106页\编辑于星期五现在是76页\一共有106页\编辑于星期五现在是77页\一共有106页\编辑于星期五2、氨肽酶法或羧肽酶法3、质谱法（MS）

灵敏度高、所需样品少、测定速度快现在是78页\一共有106页\编辑于星期五现在是79页\一共有106页\编辑于星期五现在是80页\一共有106页\编辑于星期五现在是81页\一共有106页\编辑于星期五现在是82页\一共有106页\编辑于星期五核糖体蛋白质链4.根据核苷酸序列的推定法现在是83页\一共有106页\编辑于星期五根据核苷酸序列的推定法：（1）用待测的蛋白质作抗原免疫动物抗体（2）分离多核糖体（3）抗体沉淀此种蛋白质多核糖体（4）分离该蛋白质的模板mRNA，（5）反转录成cDNA（6）根据测定cDNA序列推测蛋白质的AA序列。注意：必须知道蛋白质N-末端和C-末端氨基酸残基现在是84页\一共有106页\编辑于星期五（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（overlapingpeptide）现在是85页\一共有106页\编辑于星期五胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链经电泳分离各肽段用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置（八）、二硫键位置的确定现在是86页\一共有106页\编辑于星期五胃蛋白酶最适pH约2，此时二硫键不断开专一性低、肽段短现在是87页\一共有106页\编辑于星期五（九）、蛋白质测序举例现在是88页\一共有106页\编辑于星期五（十）蛋白质序列数据库

www.ncbi.nlm.现在是89页\一共有106页\编辑于星期五

同源蛋白质：来自不同生物体、

执行同一/相似功能的蛋白质

同种蛋白质：来自相同生物体、

执行同一功能的蛋白质

同源蛋白质的AA序列具有明显的相似性

——序列同源性（sequencehomology）

不变残基/可变残基1、同源蛋白质四、蛋白质的AA序列与生物功能（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化现在是90页\一共有106页\编辑于星期五

一百多个AA残基

MW约12.5×103

28个不变残基

序列间AA差异数与物种间系统发生差异成比例；

进化位置上相差愈远，AA序列之间的差别愈大。

细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。

2、细胞色素C与系统树现在是91页\一共有106页\编辑于星期五invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences现在是92页\一共有106页\编辑于星期五现在是93页\一共有106页\编辑于星期五现在是94页\一共有106页\编辑于星期五序列同源关系表明随机突变导致一级结构方面AA取代/趋异事件的进化顺序。

1、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化起源现在是95页\一共有106页\编辑于星期五该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶有序列同源性对底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类现在是96页\一共有106页\编辑于星期五卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三级结构很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白质现在是97页\一共有106页\编辑于星期五（三）血液凝固与AA序列的局部断裂

凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的血纤蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纤蛋白网现在是98页\一共有106页\编辑于星期五现在是99页\一共有106页\编辑于星期五（一）肽的人工合成

保护（氨基、羧基、侧链活性基团）

活化（氨基、羧基）

缩合剂

（二）胰岛素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成现在是100页\一共有106页\编辑于星期五树脂挂接现在是101页\一共有106页\编辑于星期五1.有一多肽经酸水解后产生等摩尔的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys

2.测定小肽氨基酸顺序的最好方法是A.2，4-二硝基氟苯法(FDNB法)B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法)C.氨肽酶法D.苯异硫氰酸法(PITC法)E.羧肽酶法

选择题现在是102页\一共有106页\编辑于星期五3.用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键?A.双缩脲反应B.克氏定氮C.紫外吸收D.茚三酮