定性试验质控课件

讲者介绍许斌，研究员、教授。现任江苏省临床检验中心主任，《中华检验医学杂志》编委、《临床检验杂志》常务编委和中国合格评定国家认可委员会主任评审员。联系方式：(省临检中心）临床免疫定性试验

室内质控方案江苏省临床检验中心许斌临床免疫检测类型1、定量分析：确定被分析物的含量。产生一个与待测分析物的浓度相关的光谱信号，如果有已知浓度的分析物制剂做校准，分析物的实际浓度就可以被确定。2、定性分析：只关注分析物的有或无，而不关心有多少即定量。

1）用肉眼和经验判断结果的纯定性试验2）用读数仪根据CUTOFF值或域值判定结果的量值化定性试验。

阳性结果只说明分析信号超过了分析阈值（检测限）或cut-off值（cut-off值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合）。一般针对感染原和来自天然感染或免疫接种的相关抗体的出现相关的检测。2023/4/10jsccl-xubin分析的有效性

准确性○与参考方法比较○检测的样本类型（即，质控物、病人样本等）○检测的样本数量○设定cut-off的方法●精密度/再现性○重复性：利用分子检测方法和同一个仪器对单个样本进行重复性研究○再现性：再现性研究评估天与天、操作与操作间的精密度。如果使用多个仪器，要评估仪器与仪器间的再现性；如果在多个实验室开展检测，也要评估不同实验室间的再现性。○检测的样本类型（即，质控物、病人样本等）○检测的样本数量○靠近临床cut-point和整个分析检测区间内的性能●分析的线性、回收率和高剂量钩子效应●检出限值和定量限值（在高和低的范围内）●分析特异性（交叉反应性，干扰）●基质效应●影响分析结果的分析前因素●分析输出（读数区间或阴阳性）临床有效性和临床有用性

临床有效性：检测特征（敏感性、特异性、预测值和似然比）临床有用性：利用检测结果可以获得有效治疗或有其他具体的临床获益筛选有症状个体的检测：帕金森病用于诊断和监控的检测：Heptimax®用于确认活动性丙肝病毒（HCV）感染、监控HCV治疗反应和确认感染的消退

确定预后和指导治疗的检测：OncotypeDX®利用实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织样本中21个基因的表达水平。

调整用药剂量的检测：指导华法林剂量的基因检测-基因CYP2C9（编码细胞色素P4502C9）和VKORC1（编码维生素K环氧物还原酶复合物亚单位1）的多态性

CUTOFF值的确定和验证临床化学仪器精密度分析（EP5-A2）定量分析方法线性评估（EP6-A）临床化学中干扰的测试（EP7-A2）用患者样品进行方法对比及偏倚评估（EP9-A2）临床实验室定量分析方法的初步评估（EP10-A3）体外诊断实验室要求的统一（EP11-A）定性分析性能的评价协议（EP12-A2）实验室统计-标准差（EP13-A）基质效应的鉴别和量化（EP14-A2）体外诊断产品精密度、准确度的使用证实（EP15）定量分析方法的校准确认（EP16）检测限的评估：评价、确认和论证（EP17-A）NCCLS（CLSI）方法学性能评估方案一共21个文件CLSI免疫专业相关技术标准C28-A3Defining,Establishing,andVerifyingReferenceIntervalsintheClinicalLaboratory;ApprovedGuiedline-ThirdEditionC54-AVerificationofComparabilityofPatientResultsWithinOneHealthCareSystem;ApprovedGuidelineGP10-AAssessmentoftheClinicalAccuracyofLaboratoryTestsUsingReceiverOperatingCharacteristic(ROC)Plots;ApprovedGuidelineEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuidelineCLSI免疫相关技术标准I/LA2-A2QualityAssuranceofLaboratoryTestsforAutoantibodiestoNuclearAntigens:(1)IndirectFluorescenceAssayforMicroscopyand(2)MicrotiterEnzymeImmunoassayMethods;ApprovedGuideline-SecondEditionI/LA6-ADetectionandQuantitationofRubellaIgGAntibody:EvaluationandPerformanceCriteriaforMultipleComponentTestProducts,SpecimenHandling,andUseofTestProductsintheClinicalLaboratory;ApprovedGuidelineI/LA18-A2SpecificationsforImmunologicalTestingforInfectiousDiseases;ApprovedGuideline-SecondEditionI/LA21-AClinicalEvaluationofImmunoassays;ApprovedGuidelineI/LA23-AAssessingtheQualityofImmunoassaySystems:RadioimmunoassaysandEnzyme,Fluorescence,andLuminescenceImmunoassays;ApprovedGuidelineI/LA30-PImmunoassayInterferencebyEndogenousAntibodies；ProposedGuideline临床免疫定性试验的性能指标灵敏度(sensitivity)：（1）分析灵敏度（Analyticalsensitivity）也可用检测限（Detectionlimit）表述是指可以将样品中分析物检出的最少分析物的量。（2)诊断灵敏度(Clinicalsensitivity)是指确诊的病人中检测结果为阳性或超过了检测限的病人的比例或指大量样本中阳性病人的检出能力。特异性（Specificity）：分析特异性指实验方法只检测目的构成物的能力；临床特异性指实验只对样本中的特异的分析物起反应而不对的其它物质有反应的能力。定性免疫检测的用途筛选试验用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现（如感染原或相关抗体的出现）。一般要求趋向二个极端：

1）有高的临床敏感性（即超过95%的临床检出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。

2）有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结果具有高可能性的具有这些特征。诊断试验用来评价具有可疑给予特征（如一种感染的特殊类型）的人。敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那么敏感性要尽可能的高；而且后续已有准确的确证试验，可以不需要高的特异性。感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。确证试验获得筛选或诊断试验反应性结果后，增加的试验用于证明和确认此前的反应性结果。在这种情况下，主要考虑的性能常常是特异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性预测值；特异性应该超过98到99%。确证试验可以是非免疫化学的（如，培养或脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试验）。如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预测值，则不需要确证试验。按照EP12文件找C50会出现给定C50与实测C50的区别应用的前提是以含量为基础，在C5和C95间有线性关系infection.formanymicrobiologicalqualitativetestsisnorecognizedreferencematerial.Formanysuchantigenorantibodytests,Usersmustthenrelyonthelabelingprovidedbythemanufacturerforspecificinformationonhowthecutofforlimitofblankwasestablished;orgainexperiencewiththedeviceintheirpatientpopulationtocorrelatetestresultswithclinicalfindings.CUTOFF验证值用于（1）灰区的设定；（2）Leuey-Jennings质控框图的控制限确定。美国CAP要求CUTOFF值每六个月验证一次，我们建议更换试剂批号就应进行验证。实验室为适应这样的要求可以调整订购试剂的习惯，尽量在较长一段时间内使同一批号的试剂。2023/4/10jsccl-xubin质控物的选择

基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起非特异或中和反应造成假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性的小牛血清等。稳定性：室内质控需要观察一段时间，一般选择生产者声明在一定保存条件下如2-8℃或-20℃以下有效期为6个月以上。要特别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通常前二者的有效期要短许多。实验室应对这些有效期进行验证。质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不能固定而应随机放置。试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUTOFF值或阈值的，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。浓度范围：应围绕该CUTOFF值选择。一般建议阳性质控物浓度为2×CUTOFF值左右，阴性质控物浓度为0.5×CUTOFF值左右。高值或超高值阳性血清是用来监控“HOOK效应”的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于CUTOFF值对边缘结果的监控也无任何价值。灭活：尽管所有的制造商或生产者均声明对已知的经血传播的病原体如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病原体进行了灭活处理，但应把质控物视为有传染性，因为可能存在灭活不完全以及其他未知的传染性，实际工作中应按生物安全防护的规定进行操作。冰冻血清的融化和冻干品复溶：免疫活性的质控血清一般需在-20℃以下长期保存，从冰箱取出后建议室温自然融化，一次性使用可以37℃水浴或孵箱快速融化，轻柔地颠倒混匀5次以上；融化的血清置4-8℃保存，而不应该再次-20℃以下保存、反复冻融。冻干质控品用生理盐水（非蒸馏水，除非有特殊说明）复溶，按规定的量准确（应保证每瓶操作的一致性）加入质控品容器中，盖盖后轻柔地颠倒10次以上，保证充分溶解和混匀；安琣瓶应先轻敲摇晃使顶部的冻干粉掉入底部，用砂轮划开颈部轻敲顶部使其掉落在锐器盒中，加样器加生理盐水后反复抽吸10次以上。所有操作应避免气泡产生。复溶后的质控品置4-8℃保存，也可分装小份置-20℃以下保存，只允许冻融一次。融化、复溶、分装后的血清均在标签上标志操作日期、有效期和操作者。自制质控品大量的临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自制，其步骤为：1收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清)到一定量（至少够本室使用6个月以上的量）；2传染性病原体需经56℃、10小时灭活后使用；30.2μm生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4稀释，用正常人血清稀释；5测定值，与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2倍CutOff值附近的阳性值；6分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20℃冻存备用；7稳定性及瓶间差评价。Levey-Jennings质控图

横坐标（X轴）：CLIA’88§493.1218(b)定义:测试系统的准确性、精密度保持稳定的一个间隔,不超过24小时。每个点表明的是分析批或检测日期，当检测日有多个批次时都应标出。

ELISA等板式试验应把每块板视为一个分析批；发光等均相免疫试验当一个质控失控，采取了纠偏措施后当天再次做的质控应视为另外的一个分析批，需在质控图上标出。纵坐标（Y轴）：用吸光度值或含量点图，不推荐用S/C.O点图。至少要引出中心线[质控物靶（均）值]和上下失控限三条线。中心线：靶值这个词特别容易造成歧义，实验室会误认为定值质控物提供的“靶值”就是绘制质控图中心线的靶值，用质控物均值来表示中心线更恰当。质控图的Y轴中心线应用实验室测定的质控物加权均值作图，无论是定值还是未定值质控物均如此。在启用新批号的质控物时应先与旧批号质控物平行检测3批以上，启动即刻法（Grubbs法）质控规则，建议使用2s规则；至有了20个数据后转入常规的质控方法。失控限：Westgard质控规则并不完全适合。1）其方法和试剂由于免疫学的特性、原材料等生产工艺问题使其变异较大，一般批内cv超过15%；2）免疫反应的曲线是非线性的；3）质控点测定值呈偏态分布。临床免疫检验的质控目的就是保证检测结果阳性是阳性、阴性是阴性。偶然误差的失控规则不能简单地使用13s或武断地使用12s判断是否在控。利用cutoff验证值可以直接确定上下失控限，公式为：例如：某批号的ELISA乙肝表面抗原试剂的cutoff值为0.105，其验证值为0.067，阳性质控物均值为0.215，则阳性失控上限为：0.215×[1+（0.105-0.067）/0.105]=0.292；阳性失控下限为：

0.215×[1-（0.105-0.067）/0.105]=0.137。在Y轴上的三个点为：0.292、0.215、0.137。同样，阴性质控物的均值如为0.058，则应用阳性失控限公式得到的cutoff验证值比例为36%，计算得到阴性质控在Y轴上的三个点为：0.079、0.058、0.037。系统误差的失控规则可以选用41s和/或10x，也就是要求质控图始终保留20个点以上的原因。阴、阳性质控物的测定值均应在质控图中标出：阳性重点是下限，阴性重点是上限，这样的单个超限判为失控；阴、阳性同时上限或同时下限超限判为失控；阳性上限超限而阴性未超或阴性下限超限而阳性未超，可以视为不失控。纯定性试验的质控要求

临床免疫纯定性试验大都属于CLIA’88豁免的技术（waivedtestingsites），包括免疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。对于FDA等批准家庭使用的技术，只要求检测装置有内对照，检测结果满足说明书规定即可；对于需要经验来判定结果的技术仍需在实验室进行，均有质控的要求，但国际上无具体操作的规定和资料。根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标