分子标记辅助选择(MAS)与QTL定位在鸡遗传育种中的应用

分子标记辅助选择(MAS)与QTL定位在鸡遗传育种中的应用摘要：近年来，随着畜禽基因组研究计划相继开展，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展，这为准确地评价畜禽群体遗传结构及遗传多样性提供了新的机遇分子标记辅助选择(MAS)也越来越受到育种学家的广泛关注，并且目前已用于生产实践，对提高经济效益和育种效率起到了大的推动作用。而对鸡的染色体上QTL定位工作也有了迅猛的发展，成为动物基因定位工作中一个异常活跃的领域。对鸡数量性状的研究也已发展为直接将研究目标指向各个数量性状位点，借助各种遗传标记，构建遗传连锁图谱，通过一定的统计分析方法，从而将影响数量性状的多个基因定位于特定的染色体区域。分子标记辅助选择(MAS)与QTL定位之间具有紧密联系。本文主要综述分子标记辅助选择(MAS)与QTL定位在鸡遗传育种中的研究进展。关键词：鸡；分子标记辅助选择(MAS)；QTL定位引言鸡的许多经济性状属数量性状，该类性状的发生受到2对或更多对等位基因的控制，每对等位基因没有显性与隐性的区别，而是共显性的。这些等位基因对该数量遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因(minorgene),它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitativetraitloci，QTL)。目前随着QTL研究的深入，不仅丰富和发展了数量遗传学的内容，成为新兴的分子数量遗传学的主体，也必将对畜禽的育种改良起到极大的推动作用，从而开创动物育种的新纪元。分子标记辅助选择(MAS)相关概念Stam(1986)提出通过限制性片段长度多态性(RFLP),可对生物有机体的基因组进行标记，利用标记基因型能非常准确地估计数量性状的育种值，以该育种值为基础的选择，称为标记辅助选择(markerassistedselection,MAS)。Lander和Thompson(1990)定义标记辅助选择，为把分子遗传学方法和人工选择相结合达到性状(traits)最大的遗传改进，人们进一步将MAS定义为以分子遗传学和遗传工程为手段，在连锁分析的基础上，运用现代育种原理和方法，实现性状最大的遗传改进。常用分子遗传标记及应用目前常用于家禽遗传育种的分子遗传标记主要有：(1)限制性片段长度多态(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP);(2)DNA指纹(DNAfingerprint,DFP);(3)随机扩增多态DNA(RandomlyAmplifiedpolymorphismsDNA，RAPD);(4)微卫星DNA(MicrosatelliteDNA);(5)单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP);另外随着仪器的改善和技术的不断提高，现在也发展了很多新型、高效的检测突变的方法。下面主要介绍目前家禽遗传育种中常用的分子遗传标记。2.2.1限制性酶切片段长度多态性（RFLP）RFLP标记是80年代初发展起来的第一代分子标记技术。所谓RFLP，是指用限制性内切酶处理不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针（RFLP标记）进行分子杂交，再通过放射自显影（或非同位素技术）实现的。现在的RFLP标记一般与PCR技术结合起来应用。根据待分析的DNA片段序列，设计特异引物，经PCR扩增，再用适当的限制性内切酶酶解。由于待分析的DNA片段不太长，酶解后片段不会太多，这些酶切片段经琼脂糖凝胶电泳，就可根据片段的大小将其分开。凝胶用溴化乙锭染色后，可直接在紫外灯下观察结果，比较限制性酶切片段的多态性。徐日福等（2005）在鸡的基因组中扩增了MHCB-LB基因第2外显子长度为374bp的片段，通过克隆、测序，发现了20个B-LB等位基因。对第2外显子6个限制性酶切位点的PCR-RFLP多态性进行分析，并运用在这6个位点所观测的纯合基因型组合对B-LB等位基因进行初步检测，结果显示，该方法的等位基因检出率可达65％，等位基因主型检出率为68.75％。DNA指纹标记1985年JeffreysA.J等制备出在哺乳动物和鸟类基因组DNA中检测出高度多态性的两个小卫星探针，即33.15探针（核心序列为AGAGGTGGGCAGGTGG）和33.6探针（核心序列为AGGGCTGGAGG3）用类似于RFLP分析方法，在低严谨的条件下，利用小卫星探针与基因组DNA的酶切片段进行Southern杂交，可以得到10多条的杂交图带。由于不同的个体得到不同杂交图谱，就像不同的人具有特异的指纹标识一样，所以称之为DNA指纹。DNA指纹具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性及体细胞稳定性四个特点。盛浩伟等以EAV（禽内源性反转录病毒片段）为探针,EcoRI为限制性内切酶对新扬州鸡DNA指纹图谱进行了研究。结果表明：DNA指纹J带在新扬州鸡上存在，并对新扬州鸡早期增重具有减效效应，可作为新扬州鸡早期增重的遗传标记进行标记辅助选择。RAPD标记Williams等于1990年首次运用随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，成功获得了作为分子标记的多态DNA片段。RAPD技术具有操作简便快捷，所用引物较短（通常为10个碱基），引物来源丰富而广泛，无需知道引物和模板DNA的序列，相同引物可以用于不同动物的基因组DNA多态牲检测，材料面广，样品用量少，灵敏度高等特点，目前已被广泛应用于畜禽群体遗传结构的分析。Sharma等（2001）应用RAPD技术研究5个鸡种群间的变异，发现50条随机引物中12条引物会产生多态性的RAPD图像,96条扩增片段中有25%显示多态性。研究结果表明，RAPD技术在探索鸡种群间的多态性及确定它们间的遗传距离具有高效性，同时发现白色来航鸡与其它品种遗传相似性很低。微卫星标记微卫星DNA（MicrosatelliteDNA），又称简单重复序列或短串联重复序列，由1-6bp重复序列构成的微卫星本体和两侧的侧翼序列所构成，广泛分布于真核生物的基因组中。在微卫星DNA重复序列即微卫星本体中，可变重复数的核心序列头尾相连组成串联重复序列，其可变重复数构成了微卫星DNA多态性的基础,而微卫星座位串联重复碱基的长度是影响其突变率的主要因素。与传统的标记方法相比，微卫星标记，因其高度的多态性、广泛而又随机地分布于整个基因组以及共显性遗传的特点，目前已经成为群体遗传结构、遗传多样性研究中的最普遍最有效的工具之一。微卫星多态性分析在畜禽遗传多样性评估、品种资源的分类和保存等方面发挥着重要作用。陈红菊等(2003)利用5个微卫星标记分析了日照麻鸡、寿光鸡、莱芜黑鸡、济宁百日鸡、鲁西斗鸡、安卡黄鸡和广西黄鸡的遗传多样性，结果表明日照麻鸡与济宁百日鸡的距离最近，鲁西斗鸡与其他鸡种距离均较远。SNP标记SNP的基本概念单核苷酸多态性(SingleNucleotidepolymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是人类和动物基因组中普遍存在的一种分子标记。SNP在基因组中密度高，在入类基因组中估计每300-1000bp出现一个，其遗传稳定性较高，尤其是位于基因表达序列内的cSNP(SNPincDNAsequenes)有可能直接影响基因的表达水平或蛋白质结构，影响着生物系统的表达调控网络，从而引起性状表型的变化。因此SNP位点及其突变关联分析在基因功能研究中得到了广泛的应用。鸡的SNP遗传图谱也已完成，整个鸡的染色体含有280万个SNP位点。从对生物的遗传性状的影响上来看，SNP又可分为两种：一种是同义SNP(SynonymousSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义SNP(non•synonymousSNP)，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。SNP中约有一半为非同义突变。SNP用作遗传标记具有以下优点：(l)SNP在动物群体中是等位基因性的，在任何群体中其等位基因频率都可估计出来。(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。在人类群体中，SNP的频率约占l%甚至更高。(3)与串联重复的微卫星座位相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP)，前者的高突变率容易引起对群体的遗传分析出现困难。对于大规模的研究而言，它比微卫星标记和其他的重复序列更可靠。(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是性状、疾病遗传机制的候选改变位点。(5)易于进行自动化、规模化分析，缩短了研究时间。SNP的检测方法由于SNP的二态性，非此即彼，使其具备其他分子标记无可比拟的优越性，奠定了应用DNA微阵列、DNA芯片等高新技术来发现与检测生物基因组之间差异的基础。从技术上来讲，凡是检测点突变的方法都可用于鉴定SNP，但迄今为止还没有任何一种方法是万能的。经典方法采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析、RFLP等，由于它们必须通过凝胶电泳等进行分析，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。RFLP只能检测到SNP的一部分。上述方法仅能判断SNP的有无而不能知道碱基类型，因此这些方法发现的SNP需用进行序列测定加以确认。在几种用于检测突变的PCR相关技术中，PCR-SSCP分析可能是最易操作而且是最灵敏的方法之一。该方法的基本原理是：经PCR扩增的DNA片段在变性剂(如甲酰胺)或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当DNA发生碱基置换突变(点突变)时，会造成单链构象不同，通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差别，即多态性。PCR-SSCP检测突变的能力依赖于突变对分子折叠的影响以及分子折叠对电泳迁移率的影响。目前还不能在理论上预测这些因素，因此在理论上估计PCR-SSCPP的灵敏度非常困难，根据经验估计其灵敏度也很困难，因为这种灵敏度明显依赖于被检测片段的序列。检测片段越长，PCR-SSCP分析的灵敏度越低，因此要把长的片段先降解成短的片段再进行SSCP分析。这样可以通过在重叠的亚片段上分别扩增目标序列或者通过先扩增完整片段，再用适当的限制性内切酶消化扩增片段来完成。SNP在鸡遗传育种中的应用在鸡遗传育种的过程中，人们一直致力于寻找一些可靠的遗传标记来提高育种效率。目前，建立在DNA序列基础上的分子标记以其多态性、具有共显性、不受环境和发育阶段的影响等优点，已在鸡遗传育种中引起广泛关注。随着人类基因组测序工作的完成，SNP的筛选及检测正成为研究者们广泛关注的焦点，研究与遗传表型相关的DNA序列变异是遗传学研究的主题之一，人类基因组序列和动物基因序列的变异大多数是单核苷酸的突变，而且在不同人群和动物种群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种群或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异，不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因素的反应。另外，比较物种间SNP的差异，可以了解物种间的亲缘关系和进化的生物学信息。王彦等以四川大恒家禽育种有限公司和四川省畜牧科学研究院培育的5个新品系纯系和3个杂交系鸡群为试验材料，对MC3R基因进行PCR扩增，采用PCR-SSCP技术结合测序分析了MC3R基因在上述鸡群中的多态性。结果表明8个鸡群中存在A1424G的突变；与肉质性状相关分析结果显示，1424位点仅对粗蛋白(CP)含量和肌内脂肪含量(IMF)影响显著。QTL定位相关概念畜禽的许多经济性状属数量性状，该类性状的发生受到2对或更多对等位基因的控制，每对等位基因没有显性与隐性的区别，而是共显性的。这些等位基因对该数量遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因(minorgene),它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitativetraitloci,QTL)。对QTL的定位必须使用遗传标记，人们通过寻找遗传标记和数量性状之间的联系，将一个或多个QTL定位到位于同一染色体的遗传标记旁,所以说标记和QTL是连锁的。QTL的检测方法目前借助分子生物学技术进行QTL检测的方法主要有2类，一类是标记-QTL连锁分析(mark-QTLlinkageanalysis)，也称为基因组扫描(genomescanning)；另一类是候选基因分析(candidategeneapproach)。3.2.1标记一QTL连锁分析标记一QTL连锁分析是基于遗传标记座位等位基因与QTL等位基因之间的连锁不平衡关系，通过对遗传标记从亲代到子代遗传过程的追踪以及它们在群体中的分离与数量性状表现之间的关系的分析，来判断是否有QTL存在、它们在染色体上的相对位置以及它们的效应大小。候选基因法根据已知的生理、生化知识选择具有某种功能的基因即候选基因，通过分子生物学试验检测这些基因及其分子标记对特定数量性状的效应，然后筛选出对数量性状有影响的基因或标记，并估计出它们对数量性状的效应值。QTL定位的应用3.3.1生长性状Fotouhi等(1993)利用PCR-RFLP方法分析发现鸡生长激素基因中的单核苷酸多态性可能与鸡的脂肪代谢有关。颜炳学等(2002)在明星肉鸡和丝毛乌骨鸡建立的资源群体的基础上利用PCR—RFLP标记和候选基因法经相关分析发现，IGFII基因是鸡生长、屠体性状的1个重要QTL，或与其紧密连锁。蒋思文等(2002)分析了黑素皮质素受体3(MC3R)基因的PCR-RFLP在高低体重白洛克鸡参考家系群体中的分布，结果发现MC3R基因型对公母鸡体重有显著影响。王启贵等(2001)利用PCR-SSCP标记方法，研究了细胞外脂肪酸结合蛋白基因5'调控区的单核苷酸多态性，结果发现了1个SNP的突变型具有较高的腹脂重和腹脂率(P<0.01),说明该基因对鸡的腹脂沉积有影响或与控制腹脂性状的主基因连锁。产蛋性状欧阳建华等(2000)研究了中国泰和乌骨鸡主要组织相容性复合体(majorhisto-compatibilitycomplex，MHC)基因的遗传多态性，结果发现MHC的BLII经Haem、HhaI酶切后的多态性对鸡的产蛋数和孵化率有显著和极显著影响，表明MHC除了免疫及抗病上的功能外，可能在鸡的繁殖方面同样发挥作用。抗病性状MHC基因和天然抗性巨噬结合蛋白(naturalresistanceassociatedmacrophageprotein,NRAMP)基因是与抗病有关的两个重要候选基因。MHC基因位于鸡16号染色体，是目前在鸡抗病育种上研究最多的基因，研究结果表明，鸡MHC基因多态性与鸡马立克氏病、劳氏肉瘤病、白痢病的抗病性有关。小结与展望分子标记辅助选择(MAS)与数量性状位点(QTL)的定位开展至今，已经展现出广阔的应用前景。利用分子遗传标记将QTL一旦准确定位，便能对其做详尽研究并可人为操作。通过分子技术育种，将来可能培育出多个优良性状(如生长快、肉质优、抗病力强)集于一身的鸡新品种，这正是几十年来遗传育种学家一直努力探索和追求的目标。目前，尽管鸡QTL的定位研究已取得了一定的进展，但离在育种中的实际应用还有很大的距离。由于试验群体规模较小、遗传标记的密度不足，以及QTL间存在连锁等因素的影响，导致找到的个别QTL有可能是虚假的、不存在的，因此，还需要进行独立的测定、重复试验，以验证真正的QTL。毋庸置疑，QTL定位作为21世纪家禽遗传改良的主要手段，必将为养禽业乃至全人类带来不可估量的经济效益。参考文献(References)：吴常信•优质鸡育种特点及遗传标记辅助选择(MAS)的应用[C].第三届优质肉鸡的改良、生产及发展研讨会论文集，1994.徐日福，李奎，陈国宏等.鸡MHCB-LB等位基因检测及多态性研究[J].畜牧兽医学报，2005，36(12):1247-1255.JeffreysA.J,TheinS.L.IndiVidual-specificfingerprintofhumanDNA[J].NatureStructuralBiology，1985，316：76-79.盛浩伟，王金玉，戴国俊等•新扬州瀚NA指纹J带与生产性能的关性研究[J].生物技术，2004，14(3)：18-19.WilliamsJ.G.K.DNApolymorphismsamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkers[J]．NucleicAcidsResearch，1990.18：6531-6535．SharmaD.，AppaRaoK.B．Geneticdiversityamongchickenbreedsestimatedthroughrandomlyamplifiedpo1ymorphicDNA[J]．AnimalBiotechnology，2001，12(2)：111-120．陈红菊，岳永生，樊新忠等.利用微卫星标记分析山东地方鸡品种的遗传多样性J].遗传学报，2003，30(9)：855-860．ConsortiumInternationalChickenpolymorphismsMap.AgeneticVariationmapforchickenwith2.8millionsingle-nucleotidepolymorphisms[J].Nature，2004,432：7l7-732．王彦，苏毅，刘益平等