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文档简介
本文格式为Word版,下载可任意编辑——大肠杆菌培养感受态制备质粒转化及鉴定大肠杆菌的培养
1.LB培养基配制:(液体培养基)①取1L的烧杯,参与适量的一蒸水(<1000ml),称取胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,Nacl10g倒入烧杯中
②参与磁子搅拌,至完全溶解③用NaoH调PH=7.0,定容至1L④分装后高压蒸汽灭菌(固体培养基)
①在液体培养基的基础上参与琼脂糖:1L液体培养基→15g琼脂糖(用水先溶解)②在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解③分装后高压灭菌
抗生素的参与温度要求:高压灭菌后,将溶化的LB固体培养基置与55℃的水浴中,待培养基温度降到55℃时(手可触摸)参与抗生素,以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。本卷须知:
①电炉子温度不要太高,烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网高压灭菌时,瓶盖上要插上针头,防止灭菌时瓶盖喷出2.倒平板:
培养皿要提前进行灭菌、烘干,在超净工作台里,开启酒精灯,在酒精灯的火焰旁进行操作,倒完后做好标记
3.接种(平板划线分开法):
接种环挑取大肠杆菌进行接种:图式:
注意:每次划线前接种环都要灼烧灭菌,再冷却。4.37°恒温培养箱培养:
接种好的培养皿正置15分钟,然后倒置放入培养箱过夜培养
倒置培养原因:恒温培养时,培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发,倒置培养皿则会使水蒸汽凝结成水滴留在盖上。假使正方,则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。假使培养皿中已形成菌落,则会导致菌随水扩散,很难再分成单菌落,达不到分开目的。
大肠杆菌感受态的制备及转化
感受态:细菌处于简单吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化:是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。一、制备:步骤
从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于2mL
LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
↓
以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中
↓
37℃振荡培养2~3h
↓
将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min
↓
4000rpm,离心10min回收细胞
↓
倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽
↓
用冰冷的0.1mol/LCaCl210mL,悬浮沉淀
↓
马上放在冰上保温30min
↓
4℃,4000rpm,离心10min,回收细胞
↓
用冰冷的0.1mol/LCaCl22mL悬浮细胞(务必放冰上)
↓
分装细胞,每200μl一份。此细胞为感受态细胞。
二、转化:步骤:
在200μl新鲜配制的感受态细胞中参与质粒DNA2μl(≤50ng),
混匀同时做以下对照管
(受体菌对照:200μl感受态细菌+2μl无菌水质粒对照:200μl0.1mol/LCaCl2溶液+2μl质粒)
↓
冰上放置30min
↓
将管放到42℃循环水浴热冲击90s
↓
取出,迅速冰浴2min
↓
每管加800μlLB液体培养基,37℃慢摇复苏1h
↓
取50μl已转化的感受态细胞或对照样品,各分别涂在含有或不含有氨苄青霉素的培养皿中
↓
待吸干菌液后,倒置培养皿,于37℃培养过夜
↓
次日在含氨苄青霉素的培养皿上长的菌落即为含有质粒的大肠杆菌(即转化成功)
质粒DNA的提取
1.溶液:
溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris(pH=8.0)、10mmol/LEDTA溶液Ⅱ:0.4mol/LNaoH、2%SDS溶液Ⅲ:5mol/L醋酸钾(KAc):60ml、冰醋酸:11.5ml、H2O:28.5ml2.步骤:
在锥形瓶中参与100mL液体培养基,向培养基中参与100ul氨苄青霉素
↓
挑取单菌落接种于锥形瓶中,37℃培养过夜
↓
次日,取1.5ml培养物于EP管中,4000rpm离心2min
↓
吸去培养液,使细菌沉淀尽可能枯燥
↓
将细菌沉淀悬浮于100ul溶液Ⅰ中,充分混匀,室温放置10min
↓
加200ul溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管皿,轻柔混匀混合物,冰上放置5min
↓
参与150ul预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置15min
↓
12000rpm离心15min,将上清转移至另一EP管
↓
向上清中参与等体积的氯仿(去蛋白),反复混匀,12000rpm离心5min,将上清转移至另一EP管
↓
向上清中参与2倍体积的无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min,12000rpm离心5min,倒去上清液,把EP管倒扣在吸水纸上,吸干液体
↓
用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,震荡并离心,
倒去上清液,真空抽干或空气中枯燥
↓
参与20ulTE缓冲液或无菌水,溶解DNA,-20℃保存
3.本卷须知:
①在混匀时,不能猛烈震荡,动作一定要轻柔。
②氯仿抽提完,转移上清时,一定不要吸到中间蛋白层,宁少勿多。
质粒DNA的鉴定
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
步骤:
1.制备琼脂糖凝胶电泳:在锥形瓶中参与45ml0.5×TBE缓冲液,称取0.45g琼脂糖放入
锥形瓶中,置微波炉中2min,中火加热至完全熔化,取出摇匀,则为1%的琼脂糖凝胶。2.待琼脂糖凝胶冷却至70℃时,参与10ul溴化乙锭(Eb)
3.取有机玻璃内槽,洗净晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好,一定要封严,放好梳子
4.将冷到60℃琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)
5.目视凝胶凝固后,再过半个小时,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内,参与0.5×TBE缓冲液至电泳槽中,加至液面刚没过胶板约1mm
6.加样:将buffer(染料)与被测DNA混合,用移液枪将样品参与到梳子孔中,对照滴在最下面的孔
7.电泳:接通电源,调理电压120V、电流80mA
8.观测结果:在将胶板放在紫外灯下,连接电脑,拍照。
氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml)
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。羧苄青霉素(carbenicillin)(50mg/ml)
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。甲氧西林(methicillin)(100mg/ml)
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。卡那霉素(kanamycin)(10mg/ml)
溶解100mg卡那霉素于足量的水中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素(chloramphenicol)(25mg/ml)
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml~25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。链霉素(streptomycin)(50mg/ml)
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中,最终定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。萘啶酮酸(nalidixicacid)(5mg/ml)
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中,最终定容至10
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