实验二植物核酸的提取教案

授课教师 学生人数55课 题试验二植物基因组DNA的提取授课类型授课 授课方法讲授、演示教学用具多媒体教学目的把握CTAB法提取植物基因组DNA的原理与方法教学重点理解每一步试验操作的目的教学难点试验操作过程中的一些留意事项教学过程一、背景学问DNA在细胞中存在的位置？植物细胞DNA存在的位置和动物细胞有何不同？〔图〕DNA的存在形式双螺旋构造图双螺旋构造组成染色体是怎样形成的？一级构造〔=双螺旋+组蛋白二级构造〔螺线管三级构造〔超螺线管四级构造〔染色体〕DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA小体〔一级构造，压缩7倍，再形成螺旋管〔二级构造，压缩6倍，之后再形成超螺旋管〔三级构造，压缩40倍，最终超螺旋管压缩形成染色体〔四级构造5倍，正常细胞中基因组DNA〔相当于一级构造〕形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA的环状DNA遗传物质核酸除了DNA外还有另外一种，即RNA，它与DNA在构造上的区分？〔图〕 根本单位中间的五碳糖是核糖，含氮碱基尿嘧啶〔U〕替代胸腺嘧啶〔T〕核酸的理化性质外形：DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。二、试验目的把握CTAB法提取植物基因组DNA的原理CTAB法提取植物基因组DNA的试验方法三、试验原理核酸在细胞中的存在方式，是以核酸-蛋白质复合物的形式存在，如一级构造核小体〔图：DNA螺旋+组蛋白通过低温研钵破坏植物细胞壁参加CTAB溶解细胞膜，CTAB与核酸形成核酸-CTAB复合物，使核酸与蛋白质分别。参加高盐溶液溶解核酸-CTAB复合物，参加蛋白质变性剂使蛋白质变性沉淀出来，离心除去蛋白质。参加核酸沉淀剂，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出来，离心得到核酸沉淀。四、试验仪器1.水浴锅2.离心机12管：3台10个移液枪〔包括枪头：1ml、400ul五、试验材料与药品试验材料：颖菠菜叶片1.十六烷基三甲基溴化铵〔CTAB〕商品信息：瓶装/100g。10份水，溶于热水、乙醇、三氯甲烷,易溶于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。危害：高毒，对皮肤及粘膜刺激性小，有稍微脱脂作用。2.1MTris-HClPH8.0缓冲液作用：供给一个缓冲环境，防止核酸被破坏商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。储存：室温保存。危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。〔EDTA-2Na〕作用：螯合Mg2+Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶〔DNase〕活性，活性依靠于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。液pH5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。量的消防器材。储区应备有适宜的材料收容泄漏物。危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。Tris饱和酚商品信息：瓶/250ml。Tris-HCl0.25%8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。储存：4℃避光保存。说明发生氧化，不能使用。β-巯基乙醇〔2-巯基乙醇〕作用：供给一种复原剂，这样酚类物质〔植物材料特别是老的材料中含有大量的酚类物质〕就不能被DNADNA的试验CTAB震荡时产生的泡沫的作用。商品信息：瓶/100g。混溶。水中溶解度：1mg/mL。储存：对空气敏感，易吸潮。 保持密闭，储存在阴凉、枯燥通风处。翻开了的容器必需认真重封口并保持竖放位置以防止泄漏。建议贮存温度2-8℃。危害：高毒吸入、摄入或经皮肤吸取后会中毒。 对环境有危害，对水体可造成污染。 本品可燃。〔NaCl〕作用：CTAB-核酸复合物在高盐溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析纯AR。稳定性比较好。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。危害：无水乙醇作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。互溶。30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。承受防爆型照明、通风设施。制止使用易产生火花的机械设备和工具。危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%〔体积。氯仿〔三氯甲烷〕〔酚易溶于氯仿。商品信息：瓶/500ml。储存：保存在密封的棕色瓶中。危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气渐渐被氧化生成剧毒的光气。异戊醇异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA商品信息：瓶/500ml。理化性质：无色液体，有不开心的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。酸类等分开存放，切忌混储。承受防爆型照明、通风设施。制止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和适宜的收容材料。危害：吸入、口服或经皮肤吸取有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，热能引起燃烧爆炸。异丙醇作用：DNA沉淀剂，DNA在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全，而后由于异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇，乙醇挥发快。用-20约和2.5倍体积的乙醇效果相当；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使局部DNA溶解损失；所以多项选择用-206500800010分钟就可以将异丙醇沉淀的核酸严密的离到管底。商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。水混溶，不溶于盐溶液。酸类、卤素等分开存放，切忌混储。承受防爆型照明、通风设施。制止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和适宜的收容材料。神经。常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。PVP-40〔聚乙烯吡咯烷酮〕作用：PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，削减DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。商品信息：白色塑料瓶/100g。储存：室温枯燥保存。危害：DNADNAaseDNA。商品信息：分析纯理化性质：-196℃。液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不行燃，温度极低。储存：储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。危害：汽化时大量吸热接触造成冻伤。六、试验试剂1.氯仿-异戊醇〔24:1〕100ml-20ml=80ml{氯仿96ml+异戊醇4ml}100ml，4℃保存2.酚-氯仿-异戊醇〔25:24:1〕40ml{氯仿-异戊醇〔24:1〕20ml+Tris饱和酚20ml}=40ml，4℃保存3.TE缓冲液PH8.0 50ml{10mMTris-HCl〔PH8.0〕缓冲液0.5ml+0.5MEDTA〔PH8.0〕0.1ml}→·定容到50ml4℃保存【0.5MEDTA〔PH8.0100ml{蒸馏水80mlEDTA-2Na.2H2O18.61g}→用NaOH〔约2g〕调至PH8.0→定容至100ml→·分装后高压灭菌备用。注：需参加NaOHPH8.0才能完全溶解。【10mMTris-HCl〔PH8.0〕缓冲液】的配制：10ml{1MTris-HClPH8.0缓冲液100μl9.9ml}→定容至10ml→10mMTris-HCl〔PH8.0〕缓冲液2%CTAB抽提液250ml{CTAB4g+无水乙醇5ml+水100ml}200ml烧杯中→加热溶解→再依次参加→·{5MNaCl56ml1MTris-HCl〔PH8.0〕20ml0.5MEDTA8ml}→定容至250ml→高压灭菌冷却后参加→{1%β-巯基乙醇〔400ul〕2ml+PVP-405g}→4℃保存【5MNaCl溶液】配制：100ml{NaCl29.22g90ml}→加热到80℃溶解冷却后→定容至100ml→高压灭菌备用1%〔v/v〕β-巯基乙醇】配制：10ml{β-巯基乙醇100μl9.9ml}→1%β-巯基乙醇10ml蒸馏水全部药剂用水都要纯洁水经高压灭菌冷却七、试验步骤〔一〕试验前预备研钵、异丙醇-20℃1075ml】将2%CTAB465CTAB30ml】称取301g30g】6510ml90个、药匙、移液枪1ml100400l、离心机〔10000r/min〕30m〔每管1ml60m〔每管2ml、无水乙醇12m〔每管400lTE缓冲液3ml〔每管100l〕〔二〕裂开细胞，释放溶解核酸将叶片置于预冷的研钵〔试验前-20℃预冷〕中，倒入液氮，尽快研磨成粉末；DNADNase的作用，保护DNA。将粉末参加10ml离心管中，参加1ml预热的CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；植物中酚类物质的影响。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶〔DNase〕活性，活性依靠于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。Tris-HCl供给一个缓冲环境，防止DNA被破坏。高盐溶液可以更好的溶解核酸-CTAB将离心管置于654010分钟轻轻摇摆几次。目的：水浴使CTAB抽提液和叶片充分反响。〔三〕抽提去掉蛋白质21ml-氯仿2分钟r/min离心10分钟；3层，上-中-下层：CTAB-核酸-变性蛋白-有机溶剂〔含CTAB-核酸至的10ml2ml-12000r/min离心10分钟。目的：其次次离心进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚〔四〕沉淀核酸1.留神取上清液〔含CTAB-核酸〕10ml离心管中〔尽量避开吸取中间层〕,参加2.5ml的异丙醇-20℃预冷30秒15至能见到絮状物；目的：异丙醇为DNA沉淀剂，异丙醇与CTAB-20℃预冷的异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好，异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会淀更完全。异丙醇易溶于CTAB，但不与核酸相溶。2.10000r/min离心10分钟,留神倒去上清液。目的：第三次离心使核酸沉淀到管底。〔五〕核酸的洗涤无水乙醇洗涤核酸沉淀直至无色，10000r/min离心10分钟，倾去上清液晾干。目的：异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇及多余的NaCl，乙醇挥发快。〔六〕保存向下层离心物中参加100μlTE缓冲液进展溶解，置于-20℃冰箱保存，以便下次课用。目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不行避开的存在DNase，而DNase的活性依靠于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNaseI可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNaseI可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTADNaseTris-HCl的作用主要是维持肯定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反响以及质粒转染进细胞的效率，假设接下来要做这些试验是应当避开使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。八、试验留意事项在整个试