实验动物学课79

实验动物学课79第1页/共76页第七章人类疾病的动物模型主要介绍了人类疾病动物模型概念、复制模型的意义和原则；常用疾病模型的复制方法和应用；免疫缺陷动物、转基因动物定义及其在生命科学研究中的应用。研究动物模型目的在于揭示人类疾病发病机理，寻找预防疾病的有效措施。第2页/共76页第一节动物模型概述人类疾病动物模型:（AnimalModelofHumanDiseases）

是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。动物模型的研究，实质上是有关实验动物的应用科学。动物模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（药物筛选和新疫苗开发）。第3页/共76页一、人类疾病动物模型的意义避免人体实验造成的危害可复制不易见到的疾病可复制发病率低、潜伏期和病程长的疾病严格控制试验条件，增加实验的可比性样品易得，实验操作简化有助于全面认识疾病本质第4页/共76页二、人类疾病动物模型的复制原则相似性重复性可靠性适用性和可控性易行性和经济性第5页/共76页三、人类疾病动物模型的分类（一）按产生原因分类

1．实验性动物摸型（ExperimentalAnimalModel）

又称诱发性动物模型

是指研究者通过使用物理性、化学性、生物性和复合性致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身特定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的病变，即人为地诱发动物产生类似人类疾病模型。

第6页/共76页2．自发性动物模型（SpontaneousAnimalModel）

是指实验动物未经任何人工处置，动物自然发生的疾病，或由于基因突变，通过遗传育种保留下来的动物模型。主要包括突变系的遗传疾病模型和近交系的肿瘤疾病模型。第7页/共76页3．抗疾病型动物模型（NegativeAnimalModel）

是指特定的疾病不会在某种动物身上发生，从而可以用来探讨为何这种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳动物均易感染血吸虫病，而居于洞庭湖流域的东方田鼠却不能复制血吸虫病。第8页/共76页4．生物医学动物模型（BiomedicalAnimalModel）是指利用健康动物生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病模型。

兔甲状旁腺分布比较分散，位置不固定，有的附着在主动脉弓附近，摘除甲状腺不影响甲状旁腺功能，是摘除甲状腺实验较理想的动物模型第9页/共76页（二）按系统范围分类1．疾病的基本病理过程动物模型AnimalModelofFundamentalPathologicProcessesofDisease是指各种疾病共有的一些基本病理过程模型。2．系统疾病动物模型AnimalModelofDifferentSystemDiseases是指与人类各系统疾病相应的动物模型，如消化、呼吸、泌尿、心血管、神经等系统疾病相应的动物模型。第10页/共76页（三）按模型种类分类疾病模型的种类包括整体动物、离体器官和组织、细胞株和数字模型。整体动物模型是常用的疾病模型，也是研究人类疾病常用的手段。第11页/共76页四、影响动物模型质量的因素致模因素动物因素实验技术因素1．实验季节2．昼夜不同时间的影响3．麻醉深度的影响4．操作技术的5．实验给药的影响6．对照组对造模的影响环境因素和营养因素第12页/共76页第二节常用动物模型的复制一、肿瘤动物模型

自发性动物肿瘤模型诱发性肿瘤动物模型1.肝癌二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌，雌雄不限。亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌黄曲霉素诱发大鼠肝癌

2.胃癌甲基苄基亚硝胺（MBNA）复制小鼠前胃癌3.肺癌二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌

移植性肿瘤动物模型第13页/共76页二、消化系统疾病动物模型

幽门螺杆菌感染动物模型肝硬化动物模型胃肠渍疡动物模型三、呼吸系统疾病动物模型

慢性支气管炎动物模型支气管哮喘动物模型急性呼吸窘迫综合征动物模型第14页/共76页四、心血管系统疾病动物模型动脉粥样硬化高血压动物模型五、内分泌及营养代谢性疾病动物模型

糖尿病动物模型营养性肥胖动物模型第15页/共76页六、传染性疾病动物摸型病毒性肝炎动物模型流行性出血热动物模型七、生殖医学动物模型

致畸试验动物模型前列腺增生症病理实验动物模型第16页/共76页第三节免疫缺陷动物免疫缺陷动物(immunodeficientanimal)是指由于先天性遗传突变或用人工诱导的方法建立的一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。第17页/共76页一、免疫缺陷动物的分类1先天性免疫缺陷动物：

a.T淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠

b.B淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠

c.NK细胞功能缺陷动物：Beige小鼠

d.联合免疫缺陷动物：SCID小鼠等2获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠、猫等AIDS模型第18页/共76页二、免疫缺陷动物的特征及其应用1．裸小鼠(nudemice)(1)发现与培育：裸鼠(nu/nu)1962年由英国格拉斯哥医院的Grist在非近交系小鼠培育中偶尔发现无毛小鼠。1966年经英国爱丁堡研究所的Flanagan证实，这种小鼠是由于11号染色体上的等位基因发生突变所致。1968年Pantelouris研究发现该无毛小鼠没有胸腺。1969年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功第19页/共76页(2)裸小鼠的主要缺陷特征：①被毛生长发育异常，表现为全身形似无毛，呈裸体状；②无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的上皮细胞，这种上皮细胞不能使T细胞正常的分化，因而免疫力低下；③细胞正常，成年裸小鼠的NK细胞活性较高，但幼鼠的NK细胞活性相对低下。第20页/共76页(3)裸小鼠在生物医学研究中的应用：①在组织移植(人类肿瘤)研究方面②在肿瘤药物治疗和肿瘤免疫研究方面③免疫和遗传研究方面④病毒、细菌、寄生虫感染机制的研究方面⑤其他方面的研究第21页/共76页2．裸大鼠(nuderat)

(1)裸大鼠的发现与培育：1953年由英国的阿伯丁研究所发现，基因符号为rnu；1975年又发现了纯合子的裸大鼠(nu／nu)，1977年在英国的MRC实验动物中心建立了裸大鼠种群。此后逐步引入美国、日本等。1983年引人中国。第22页/共76页(2)裸大鼠的一般特征：①体毛稀少，裸大鼠并不像裸小鼠一样完全无毛，而是体毛稀少，尾根往往多毛；②发育迟缓与裸小鼠一样发育相对较缓慢，体重为正常大鼠的70％左右；③繁育能力差，由于裸大鼠与裸小鼠一样在妊娠期间乳腺发育缺损，故其繁殖方式同裸小鼠相同，即用纯合子的雄鼠与杂合子的雌鼠交配方式进行繁育；④易患呼吸道疾病，由于其无胸腺，免疫力低下，因此易感各种疾病，特别是在环境较差时，易感溃疡性气管炎和化脓性支气管炎等，生存时间约6～7个月。第23页/共76页(3)裸大鼠的免疫缺陷特征：①免疫器官的组织学与裸小鼠相似，幼龄裸大鼠的解剖发现，有胸腺残迹，内有未分化的上皮细胞，但未见淋巴细胞；②先天性无胸腺，无T细胞，T细胞功能缺失，但B细胞功能正常，NK细胞的活力较正常鼠高。第24页/共76页(4)裸大鼠在生物医学上的应用：主要用于人体肿瘤的移植研究。进行外科手术，为各部位肿瘤移植和肿瘤供血研究提供了方便。第25页/共76页（二）B淋巴细胞缺陷动物又称为性连锁免疫缺陷小鼠（X-LinkedImmuneDeficiencyMice，XID）

起源于CBA／N品系，其B细胞功能缺陷，基因xid，位于X性染色体上。纯合子雌鼠（xid／xid）和杂合子雄鼠（xid／Y）对非胸腺依赖Ⅱ型抗原没有体液免疫反应，血清中IgM和IgG含量降低，对B细胞分裂素缺乏反应，B细胞数量减少，T细胞功能正常。其病理与人类Bruton丙种球蛋白缺乏症和Wziskott-Aidsch综合征相似。第26页/共76页（三）NK细胞缺陷Beige小鼠（四）严重联合免疫缺陷小鼠

第27页/共76页第四节转基因动物

一、转基因动物的概念转基因动物是指基因组中稳定地整合有以实验方法所导入的外源基因或特定DNA片段的动物。嵌合体动物（chimericanimal）：只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。

逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。第28页/共76页二、转基因动物的原理方法第29页/共76页转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载体法6、YAC法（YAC：酵母人工染色体）第30页/共76页三、转基因动物的制备实验程序如下：（1）准备假孕母鼠（养母）（2）受精卵的准备（3）基因导入（4）胚胎移植（5）对幼鼠的鉴定第31页/共76页人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。第32页/共76页四、转基因动物的应用1、动物乳腺生物反应器

1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α-抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。

“生物反应器”的概念也由此产生。第33页/共76页目前已在下列动物的乳汁中生产出一些人类蛋白质药物：牛：抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白C等；山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、组织纤溶原激活因子、单克隆抗体等；绵羊：抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅸ、蛋白C；猪：凝血因子Ⅸ、蛋白C、纤维蛋白原、血红蛋白。第34页/共76页2、建立疾病模型，用于疾病研究和药物筛选等目前已建立的疾病模型有：癌症、动脉粥样硬化、镰状细胞性贫血、囊状纤维化、红细胞增多症、肝炎、免疫缺陷、自发性高血压等。3、用于育种，提高育种效率转基因技术用于育种，不仅可以加快改良遗传性状的进程，使选择的效率提高，改良的机会更多，而且不会受到有性繁殖的局限。第35页/共76页目前转基因动物研究领域尚存在：1）制备的效率低制备一只转基因小鼠，需40个注射过的受精卵，而绵羊、山羊、猪、牛分别为110、90、110和1600。而转基因个体的后代中只有50%表达基因）2）转入的基因不能表达或表达混乱3）不能遗传给后代等。第36页/共76页第五节胚胎工程技术胚胎工程技术主要是指从雌、雄生殖细胞至囊胚的体外操作技术，包括人工授精、同期发情、超数排卵、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、胚胎嵌合、体外授精、显微授精、性别控制、基因转移、胚胎干细胞、细胞核移植、卵母细胞激活与孤雌发育等等。第37页/共76页(一)胚胎分割用显微术将未着床的早期胚胎一分为二，四或更多，然后分别移植给受体，妊娠产仔。一枚胚胎可克隆出两个或两个以上的后代。Mular等于1968年将兔的2～8细胞期胚胎一分为二，移植给受体获得成功。70年代，利用胚胎分割先后得到小鼠、牛、山羊、马和猪的同胚双生后代。1986年，西北农业大学张涌、窦忠英等分别获得胚胎二分割的同胚双鼠和半胚犊牛。1987年，谭丽玲等，奶牛，张涌等，山羊获得同胎双生后代。1988年，杜森等，获得同胚双生后代兔。1992年，徐宁等得同胚三鼠6组。1996年陶涛等得胚胎单细胞(分裂球)移植仔猪。目前，小鼠、家兔、山羊、绵羊、猪等实验动物均可用胚胎分割技术获得同卵孪生后代。第38页/共76页(二)胚胎嵌合将两枚或多枚胚胎细胞聚合共同发育成一个胚胎，称为嵌合体(chimera)。两种以上不同基因型(如A和B)的变精卵，复合而发育成的个体也称为嵌合体，又称异表型体(allophenics)。小鼠、大鼠、兔、牛、猪、山羊嵌合体以及大鼠小鼠、绵羊-山羊、马-斑马和牛-水牛等属间嵌合体第39页/共76页嵌合体小鼠第40页/共76页(三)胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)来源于胚胎的内细胞团(innercellmass，ICM)和原始生殖细胞(primordialgerm，PGC),具有发育全能性(具有分化发育成三个胚层细胞的潜力)的细胞,是动物多种组织细胞的祖细胞。能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。

第41页/共76页（四）细胞核移植第42页/共76页（五）卵母细胞激活与孤雌发育第43页/共76页思考题：1、什么是疾病动物模型？2、使用人类疾病动物模型的意义？3、免疫缺陷动物？祼小鼠、裸大鼠的生物学特性？4、转基因动物、原理、方法和应用？5、胚胎工程技术包括哪些？6、什么是ES细胞？第44页/共76页第八章动物实验技术第45页/共76页第一节实验动物的选择基本原则实验动物的选择是动物实验研究中首要考虑的问题之一，不同实验的研究目的和要求不同，不同种类实验动物也有其各自的生物学特点和解剖生理特征。第46页/共76页选择动物应遵循的原则是：一、相似性原则是指利用动物与人类某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物。

组织结构方面系统机能方面生理特性方面繁殖特性方面体液成分方面解剖特性方面1．骨骼构成2．脏器构成3．脏器形态

疾病特点方面第47页/共76页二、特殊性原则是指利用不同种系的实验动物机体存在的特殊构造或某些特殊反应选择解剖、生理特点符合实验目的和要求的动物。保证实验成功的关键减少实验准备方面的麻烦降低操作难度第48页/共76页三、标准化原则是指动物实验中选择和使用与研究内容相匹配的标准化的实验动物。遗传学微生物学环境营养控制第49页/共76页四、规格化原则是指选择与实验要求一致的动物规格。动物的种类及品系动物的年龄体重性别生理及健康状况等。第50页/共76页1岁的犬对应人的年龄约为15岁；2岁的犬对应人的年龄约为24岁；5岁的犬对应人的年龄约为36岁；8岁的犬对应人的年龄约为48岁；10岁的犬对应人的年龄约为56岁；12岁的犬对应人的年龄约为64岁；14岁的犬对应人的年龄约为72岁；16岁的犬对应人的年龄约为80岁。第51页/共76页五、经济性原则是指尽量选用容易获得、价格便宜和饲养经济的动物。第52页/共76页在具体实际工作中：首先必须了解实验动物生物学特性方面的基本知识，为正确选择合适的动物打下基础。其次，还应充分查阅相关文献，利用前人的实践经验积累，选择科研、检验和生产传统上应用的实验动物。同时，加强与实验动物科学工作者的交流，及时有效地利用实验动物学的最新成果。则可用较少的人力、动物和时间，以最小的代价最大限度地获得科学性强的实验结果。第53页/共76页第二节常见动物实验中实验动物的选择药理学研究中的选择毒理研究中的选择心血管系统免疫学传染病学寄生虫病学环境科学畜牧兽医学第54页/共76页第三节动物实验前的准备准备工作的内容有：饲养室和饲养器具的准备动物数目的确定动物的购入动物的称重动物的分组标记及动物的管理等。第55页/共76页动物的购入时注意事项1．各项实验前的准备工作是否已落实，如动物笼具数量、清洁卫生情况、动物观察室内是否已消毒。2．购入动物时应向供应部门索取动物的遗传背景资料、实验动物有效的质量合格证、实验动物微生物控制的检查资料以及动物的年龄和健康等方面的资料。第56页/共76页3．如若是清洁级以上级别的动物，其运输工具应严格检查密封状况。购入动物回到实验室的时间不宜太长。如若是长途运输，还应考虑到途中各种因素对动物的影响，如运输环境的温度、湿度、饮食等等。尤其要注意动物在途中不能被污染和引起窒息死亡。第57页/共76页4．动物健康检查：应对购入动物的健康情况进行详细检查，检查包括：（1）外观。一般常发生异常的部位及其外观检查内容有：皮毛：有无光泽和脱毛变化。口腔：流涎、出血、粘膜汤疡、口臭等。鼻腔：鼻汁、出血、干燥（有些动物鼻镜干燥）。眼：眼屎、流泪、白内障、角膜损伤等。耳：外伤、耳壳曲折、贫血、中耳炎等。尾：弯曲、断折等。四肢：弯曲、脱臼、外伤、关节炎等。肛门：下痢、血便、脱肛等。（2）营养状况。被毛逆立、精神倦怠、瘦弱或过肥等属于营养不良。（3）饲料、水摄入量。有无采食减少、食欲低下、过食等。（4）动物状态。不活动、转圈运动、卧地不起、跛行、痉挛等属不正常。第58页/共76页动物的标记1．染色法染色法是用化学试剂在动物身体明显部位如被毛、四肢等处进行涂染，或用不同颜色等来区别各组动物，是实验室最常用、最容易掌握的方法。常用的标记液有：①3％～5％苦味酸溶液（黄色）。②0．5％中性红或品红浴液（红色）。③2％硝酸银溶液（咖啡色，涂后需光照10分钟）。④煤焦油酒精溶液（黑色）。标记时用标记笔蘸取上述溶液，在动物体表不同部位涂上斑点，以示不同号码。编号的原则是：先左后右，从前到后。第59页/共76页2．烙印法3．挂牌法4耳孔法一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用挂牌法和烙印法。第60页/共76页动物体重（g）日饲料量（g）日饮水量（ml）小鼠18~253~55~7大鼠120~25015~2020~25豚鼠400~60020~3030~120兔1500~250080~100150~200第61页/共76页第四节动物实验中的基本操作一、实验动物的抓取和固定1、小鼠2、大鼠3、豚鼠4、兔5、犬第62页/共76页二、实验动物的麻醉三、实验动物的给药方法第63页/共76页四、体液的采集（一）、血液采集1）、小鼠、大鼠的尾静脉采血2）、小鼠、大鼠眼眶静脉丛采血3）、豚鼠的心脏采血4）、兔耳缘静脉采血5）、兔耳中央动脉采血第64页/共76页（二）、消化液采集1）胃液