酶的生产与分离纯化瑶瑶课件

酶的生产与分离纯化

1酶的生产组织提取发酵生产化学及生物合成2集中垄断，市场全球化：丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）美国杰能科（Genencor）、芬兰科特和丹麦丹尼斯克国际趋势3酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要酶的过程5能用于酶发酵生产的细胞需具备如下几个条件：（1）产酶量高（2）容易培养和管理（3）产酶稳定性好（4）利于酶的分离纯化（5）安全可靠6酶的发酵技术为什么利用微生物产酶？(1)种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2)生长繁殖快，易提取酶.(3)培养基来源广泛、价格便宜。(4)微电脑，连续化、自动化，经济效益高。(5)利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，7（1）枯草芽孢杆菌细菌属菌落粗糙，不透明生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。9（2）大肠杆菌阴性，无芽孢菌落光滑用于谷氨酸脱羧酶，天门冬氨酸酶等胞内酶10（3）黑曲霉属于真菌属糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等。11（5）根霉主要用于糖化酶、淀粉酶、转化酶等生产13（6）毛霉蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。14（7）链霉菌葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶等15产酶菌株的选育主要依据酶催化的反应性质、作用底物的特异性、底物和产物的特性以及酶在细胞中所处的位置。胞外酶：菌落周围的透明圈、颜色变化来筛选。胞内酶：若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色变化。而多数胞内酶产生菌的筛选：细胞破碎物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选（辅酶NAD）。17选择性能优良的产酶微生物培养基设计选择合适的发酵方式发酵过程的各种参数控制酶的发酵技术重要18保藏细胞细胞活化细胞扩大培养原生质体固定化细胞固定化原生质体预培养发酵发酵分离纯化酶重要19（1）碳源当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。重要吃点啥？21重要有机碳的主要来源有：一是农副产品中二是野生的原料以石油产品中12～16碳的成分22考虑营养要求、诱导作用、分解代谢物阻遏作用。α－淀粉酶生产用淀粉不用果糖重要23只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低使用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3%的无机氮源。重要黑曲霉酸性蛋白酶的生产25（3）碳氮比一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)低;淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)高,在糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。26（5）生长因子

微量的物质，或生长素。某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶。重要有你才健康！29（6）产酶促进剂产酶促进剂一是诱导物，二是表面活性剂。表面活性剂能增加细胞的通透性，改善氧的传递速度，保护酶的活性。重要30发酵方式的选择固态发酵法液体深层发酵法31(1)pH对产酶的影响一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液，pH低；C/N低，pH高。添加缓冲液；调节通风量.调节培养基的初始pH；pH过高糖或淀粉来调节，pH过低氮调节。

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一般细菌为37℃，霉菌和放线菌为28～30℃，而生产糖化酶的最适温度为37～40℃。(2)温度对产酶的影响

微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度发酵初期菌体繁殖旺盛时33(3)耗氧量和通风量对产酶的影响溶解氧而定。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，采用自动测定和记录溶解氧的仪表。34(4)搅拌的影响有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，提高新陈代谢。打破空气气泡，使发酵液形成湍流，提高溶氧量，增加空气利用。35(5)泡沫的影响泡沫阻碍了CO2的排除，影响溶氧量机械消泡，消泡剂36食品用酶发酵生产实例1、α-淀粉酶的生产生产菌种：细菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体深层发酵。回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附等。372、果胶酶的生产生产菌种：真菌如曲霉菌、青霉菌，细菌如枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌。发酵：固体曲法和液体深层发酵回收：水提后加入乙醇沉淀。38酶的分离纯化39酶的纯化特定的一种酶在细胞中的含量很少酶可以通过测定活力加以跟踪40酶分离纯化的一般原则1、可靠和快速的测活方法；2、酶原料的选择；3、酶的提取；4、酶的提纯；5、酶的纯度检验。41酶提取分离纯化技术路线发酵培养动物器官植物组织微生物提取胞内酶胞外酶细胞破碎研磨酶分离纯化离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶浓缩酶贮存42机械破碎捣碎法研磨法匀浆法

物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法

化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。使组织、细胞的外层结构破坏对细胞膜的作用通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞破碎方法及其原理43

(1)机械(匀浆)法(2)超声波法

处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理。生物组织的破碎44(3)冻融法

生物组织冰冻后，胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)。(4)渗透压法(5)酶消化法45(6)化学破碎法

①有机溶剂处理②表面活性剂处理与细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。46酶的提取盐溶液提取酸溶液提取碱溶液提取有机溶剂提取47温度：一般在00C~100C。pH：在酶的稳定范围内，远离等电点pH。缓冲液：0.15mol/L氯化钠、0.02~0.05mol/L磷酸提取液体积：一般为原料体积的1-5倍。保护剂：底物、辅酶、某些抗氧化剂、表面活性剂等。48酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶49酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、萃取分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、过滤与膜分离Go501、沉淀分离溶解度降低从溶液中沉淀析出沉淀分离方法分离原理

盐析沉淀法蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶液中添加一定浓度的中性盐等电点沉淀法等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点

有机溶剂沉淀法有机溶剂中的溶解度不同复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶51介电常数降低、使酶蛋白脱水

有机溶剂法52影响有机溶剂沉

淀法分离的因素

温度pH离子强度蛋白质浓度常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等

。选择有机溶剂的标准必须与水完全混溶;不与蛋白质发生反应；要有较好的沉淀效应；溶剂蒸汽要无毒，且不易燃。53阴极阳极pH=pIpH<pIpH>pI带正电荷带负电荷净电荷为零导电率溶解度渗透压粘度达到最低等电点沉淀法原因:在等电点时，蛋白质分子以双极离子存在，总净电荷为零,颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。

电泳分离沉淀分离……54pH=pI溶解度最小等电点沉淀与分离大部或全部沉淀下来pH<pI或pH>pI蛋白质的分离沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解于水并具有生物活性。55离心分离离心力使不同大小、不同密度的物质分离。颗粒大小、密度和特性的不同离心的形式：离心沉降离心过滤离心分离和超离心56超速离心机高速离心机沉降离心机57萃取分离利用物质在两相中的溶解度不同。两相一般互不相溶有机溶剂萃取

双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取

58有机溶剂萃取

常用的溶剂：醇、酮、丁醇、苯酚等。萃取条件：00C~100C。接触时间尽可能短。59双水相萃取

（two-aqueousphasesystemextraction）利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。

影响分配的因素：

双水相的性质、分离物质的性质、离子性质、环境因素

60层析分离利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，并以不同速度移动。61欲分离的混合溶液自柱顶加入洗脱剂。解吸、吸附、再解吸、再吸附

吸附层析62吸附剂与洗脱剂的选择洗脱剂的选择极性种类有：醇、酮、酚等。洗脱剂的选择要注意下列各点：洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解；洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好纯度63离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同阳离子交换剂阴离子交换剂

离子交换层析64凝胶过滤分子筛层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同

凝胶层析65凝胶过滤(gelfiltrationchromatography)溶质分子的大小操作方便，不会使物质变性，反复使用凝胶层析剂的容量比较低66原理67

葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶

68生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力酶与底物酶与竞争性抑制剂抗原与抗体酶RNA与互补的RNA分子或片段RNA与互补的DNA分子或片段

亲和层析69根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析 疏水层析金属离子亲和层析 免疫亲和层析染料亲和层析 凝集素亲和层析

70分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同固定相、流动相

在流动相的带动流经固定相动态分配。

纸上层析分配薄层层析分配气相层析71电泳分离使用的支持体的不同：薄层电泳纸层析薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳

本身所带的净电荷量、颗粒形状颗粒大小、电场强度、溶液pH值、离子强度、支持体的特性72过滤与膜分离借助于过滤介质，滤纸、滤布、纤维过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质

膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质

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膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析74酶分离、纯化的评价酶的产量是以活力单位表示，比活力、总活力75酶活力的测定酶活力(Enzymeactivity)：酶催化反应的能力，酶的含量。1min催化1μmol底物转化为产物的酶量为该酶的一个活力单位(国际单位)，温度为25℃，其它条件(pH、离子强度)采用最适条件。重要76酶的总活力为样品的全部酶活力。总活力=酶活力×总体积(mL)或=酶活力×总质量(g)77比活力(Specificactivity)：单位蛋白质所含有的酶活力。酶纯度重要78回收率(Yieldpercent)：提纯前与提纯后酶的总活力之比。酶的