高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯试验报告

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1553607胡艺蕾

试验时间：2023年4月1日试验温度：19.0℃

一、试验目的

1、了解高效液相色谱仪的组成及其工作原理和基本操作。2、对邻苯二甲酸酯进行分开和测定。

3、探究不同滚动相及不同滚动相比例对流速、柱压、保存时间及分开度的影响。4、了解液相色谱法定量测定的原理。

二、试验原理

1、试验采用的反相液固吸附色谱法，其分开机理是：当滚动相通过吸附剂时，在吸附剂（固体相）表面发生了溶质分子取代吸附剂上的溶剂分子的吸附作用。固体相为非极性分子，如十八烷基键合相，滚动相为极性分子。

2、组分分子与吸附剂之间作用力的强弱决定它的保存时间。溶质分子官能团的性质和分子结构的空间效应都会影响其出峰的顺序。本次试验为邻苯二甲酸酯，其分子官能团都一致，但由于DMP其官能团相邻的烷基较小，导致其保存值最小，因此出峰顺序为：DMP(邻苯二甲酸二甲酯)>DEP(邻苯二甲酸二乙酯)>DBP.(邻苯二甲酸二丁酯)。

3、在吸附色谱中，滚动相的洗脱能力与溶剂的极性有关，极性越大，洗脱强度也越大。本次试验使用的三个滚动相的极性大小为：水>乙腈>甲醇。寻常选择二元混合溶剂作为滚动相。4、定量分析中，定量峰与其他峰之间的分开程度称为分开度R:

寻常用塔板数n来描述色谱的柱效：

三、试验仪器与试剂1、仪器

Agilent1260高效液相色谱仪：脱气机：真空室内半透膜管路，对滚动相进行脱气四元泵：二元泵各控制一种溶剂

可设置的流速范围：0.001–10mL/min0.001mL/min步进UV检测器：用于检测通过样品后的紫外光

类型：双光束光路设计

光源：氘灯波长范围：190–600nm

手动进样器：进样20μL

色谱柱：填料:十八烷（适合中性、弱酸碱）4.6×100mm,3.5μm2、试剂

滚动相：纯水、甲醇、乙腈样品：DMP、DEP、DBP

四、试验步骤

1、开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动软件。

2、预先脱气（直到导管中无气泡），设定波长：220nm。3、设定流速、滚动相比例等参数，选择适合的滚动相。4、进样阀柄置于“LOAD〞，进样针用乙醇洗涤2-3次，取样，进样，将进样阀扳至“INJECT〞。5、保存并处理数据。

五、试验结果1、样品：DMP1:20水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速：1.00ml/min

2、样品：DMP1:10水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速：1.00ml/min

3、样品：DMP1:20水溶液10μL滚动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速：1.00ml/min

比较1和2的峰面积和峰高可以发现，在进量一定时，峰面积和峰高与样品的浓度成正比。比较1和3可发现，在样品浓度一致时，峰面积和峰高与样品的进量成正比。因此我们可以得出结论，峰面积和峰高与参与样品的物质的量成正比，这也是液相色谱法进行定量分析的依据。对这三组数据画出标准曲线：

250020001500100050000.000.501.001.502.002.50y=151.3x+36.69R2=0.997标准曲线图y=1204.x-129.3R2=0.998峰面积峰高由标准曲线可以看出：

峰面积和峰高与样品的量基本成线性关系，且峰面积的相关性比峰高的相关性要高，更适合用于定量分析。

4、样品：混合样品1:10水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：30%甲醇：70%流速：1.00ml/min

计算分开度和塔板数

R12=2.292-1.519/(0.0995+0.1174)/2=7.128R23=11.259-2.292/(0.3067+0.1174)/2=42.29nDMP=16*(1.519/0.0995)^2=3.729E3nDEP=16*(2.292/0.1174)^2=6.098E3nDBP=16*(11.259/0.3067)^2=2.156E4

5、样品：混合样品1:10水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速：1.00ml/min

计算分开度和塔板数

R12=5.087R23=33.59

nDMP=2.415E3nDEP=1.052E4nDBP=2.408E4

6、样品：混合样品1:10水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速：0.70ml/min

计算分开度和塔板数

RDMP=2.781-2.088/(0.1200+0.0993)/2=6.320RDEP=8.004-2.781/(0.0993+0.2087)/2=33.92nDMP=16*(2.088/0.1200)^2=3.633E3nDEP=16*(2.781/0.0993)^2=1.255E4nDBP=16*(8.004/0.2087)^2=2.353E4

7、样品：混合样品1:10水溶液20μL滚动相的比例为：高纯水：10%乙腈：90%流速：1.00ml/min

计算分开度和塔板数R12=1.680R23=9.123

nDMP=1.454E3nDEP=2.815E3nDBP=1.353E4

根据上述结果我们可以发现，DMP和DEP的分开度比DEP和DBP的分开度要小。

比较结果4和5可以发现，使用乙腈的保存时间较甲醇短，这说明洗脱能力乙腈>甲醇。但是使用甲醇的分开度较使用乙腈的分开度高。

比较结果5和6可以发现，减小流速会增加保存时间，但同时分开度会增加，塔板数也会增加。

比较结果5和7可以发现，增加二元滚动相中乙腈的比例，会使得保存时间缩短，但由于对DEP和DBP的影响要大于对DMP的影响，因此DMP和DEP的峰发生了重叠，导致分开度下降

六、思考与探讨

1、为什么要预先脱气？

①输液量能够均匀确凿，压力波动小；②保存时间及色谱峰面积的重现性会更好；③气泡会在谱图中出现尖峰，脱气后能使基线稳定；④保护色谱柱，防止填料氧化；2、为什么使用二元溶液作为滚动相？

利用不同比例滚动相对分开度和出峰时间的影响（往往是相反的作用）进行梯度洗脱。通过程序设定，不同时间（不同物质）来设定滚动相中甲醇和水的比例，既达到较好的分开度，又能缩短不必要的时间4、为什么会前伸/拖尾？

1、色谱柱被污染2、样品过载3、样品溶剂过强

5、操作注意：

1.本试验采用紫外来做检测器，由于查阅资料可知邻苯二甲酸酯的最大