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本文格式为Word版,下载可任意编辑——第十三章RNA的生物合成第十三章RNA的生物合成
RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。
转录(transcription):以一段DNA的遗传信息为模板,在RNA聚合酶作用下,合成出对应的RNA的过程,或在DNA指导下合成RNA。
转录产物:mRNA、rRNA、tRNA、小RNA
除某些病毒基因组RNA外,绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。转录研究的主要问题
①RNA聚合酶②转录过程③转录后加工④转录的调控①~③是基本内容,④是目前研究的焦点,转录调控是基因调控的核心。转录与DNA复制的异同:
一致:要有模板,新链延伸方向5’→3’,碱基的参与严格遵循碱基配对原则。相异:①复制需要引物,转录不需引物。
②转录时,模板DNA的信息全保存,复制时模板信息是半保存。③转录时,RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用,无5’→3’及3’→5’外切活性。转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。基因表达的终产物:①RNA②蛋白质转录过程涉及两个方面①RNA合成的酶学过程
②RNA合成的起始信号和终止信号,即DNA分子上的特定序列。DNA正链:与mRNA序列一致的DNA链。负链:与正链互补的DNA链。
转录单位的起点核苷酸为+1,起点右边为下游(转录区),转录起点左侧为上游,用负数表示:-1,-2,-3。
第一节DNA指导的RNA合成(转录)
RNA链的转录,起始于DNA模板的一个特定位点,并在另一位点终止,此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因(真核),也可以是多个基因(原核)。
基因的转录是有选择性的,细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变,将转录不同的基因。转录的起始由DNA上的启动子区控制,转录的终止由DNA上的终止子控制,转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。
一、RNA聚合酶
RNA合成的基本特征
①底物:NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)②RNA链生长方向:5’→3’
1
③不需引物④需DNA模板反应:
RNA聚合酶/DNA模板、Mg2?n1ATP?n2GTP?n3CTP?n4UTP???????????????RNA?(n1?n2?n3?n4)PPi1、E.coliRNA聚合酶(原核)
E.coli和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA)。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任一时刻,大部分聚合酶(5000左右)正在参与RNA的合成,具体数量依生长条件而定。
E.coliRNA聚合酶全酶(|holoenzyme)分子量46万Da,由六个亚基组成,α2ββ’σω,另有两个Zn2+。无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,参与σ亚基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子。
E.coliRNA聚合酶各亚基的大小与功能:
亚基β’βσαω亚基数11121分子量基因(KD)16015070379rpoCrpoBrpoDrpoA功能与模板DNA结合与核苷酸结合,起始和催化部位。起始识别因子与DNA上启动子结合不详不同的细菌,β’、β、α亚基分子量变化不大,σ亚基分子量变化较大,44KD~92KD。
σ亚基的功能:核心酶在DNA上滑动,σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使聚合酶迅速找到启动子并与之结合,σ亚基本身无催化活性。
不同的σ因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。
不同的原核生物,都具有一致的核心酶,但σ亚基有所区别,这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开,转录后DNA依旧保持双链的结构。
P360图20-1RNA聚合酶的活性中心
核心酶覆盖60bp的DNA区域,其中解链部分17bp左右,RNA-DNA杂合链约12bp。
纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的两条链中只有一条可用于转录,这可能是由于RNA聚合酶在分开时丢失了σ亚基引起的。
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方向重新螺旋化,活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。
2
37℃时,RNA聚合酶的聚合速度可达40~100个核苷酸/秒
2、真核生物RNA聚合酶
真核生物的转录机制要繁杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右,亚基数分别为6-15。
P362表20-3真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞,RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而RNApolⅠ不受抑制。
动物RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的RNApolⅢ不受抑制。
除了细胞核RNA聚合酶外,还分开到线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类的RNA,类似于细菌RNA聚合酶。
3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶
仅为一条分子量11KD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其作用,37℃时的聚合速度200nt/秒。
二、RNA聚合酶催化的转录过程(E.coli)
P361图20-2
1、起始
RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位,局部解开双螺旋,第一个核苷酸掺入转录起始位点,此后开始RNA链的延伸。
在新合成的RNA链的5’末端,寻常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷(pppG或pppA),即合成的第一个底物是GTP或ATP。
起始过程中,σ因子起关键作用,它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合,σ亚基与β’结合时,β’亚基的构象有利于核心酶与启动子紧凑结合,。
正链:与mRNA序列一致的两、链。负链:模板链。
转录起点是+1,上游是-1。
2、延长
转录起始后,σ亚基释放,离开核心酶,使核心酶的β’亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在DNA上移动速度加快,使RNA链不断延长。
转录起始后,σ亚基便从全酶中解离出来,然后nusA亚基结合到核心酶上,由nusA亚基识别序列序列。
3
3、终止
RNA聚合酶到达转录终止点时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应中止,RNA链和聚合酶脱离DNA模板链,nusA又被σ亚基所取代。。
由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。
三、启动子和转录因子
启动子:RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。
转录因子:RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转录因子。
踪迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。P363
(一)原核启动子结构与功能
分析比较上百种启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。
(1)、-10序列(Pribnow框)
在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列TATAAT,称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间,每个位点的保守性在45%-100%。
频度:T89A89T50A65A65T100
据预计,Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。目前认为,Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物,Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶稳固的结合位点,是启动子的关键部位。
RNA聚合酶的结合,诱导富含AT的Pribnow框的双链解开,然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物,在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。
(2)、-35序列(Sexfamabox)(识别区域)
只含-10序列的DNA不能转录,在-10序列上游还有一个保守序列,其中心约在-35位置,称为-35序列,此序列为RNA酶的识别区域。
各碱基出现频率如下:T85T83G81A61C69A52,其中TTG十分保守。
-35序列的功能:它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此,-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的启动子。
-35序列提供RNA聚合酶识别信号,-10序列有助于DNA局部双链解开,启动子结构的不对称性决定了转录的方向。P364图20-4原核型启动子的结构
4
(二)真核启动子
真核基因的转录十分繁杂,对启动子的分析要比原核基因的困难得多。
真核生物有三种RNA聚合酶:RNA聚合酶I、II、III,分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA,这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。
1、RNA聚合酶Ⅱ的启动子
RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区:(1)、TATA框(Hogness框)中心在-25至-30,长度7bp左右。
碱基频率:T82A97A85A63(T37)A83A50(T37)(全为A-T,少数含有一个G-C对)。
此序列功能:使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TATA框,转录将可能在大量位点上开始。
TATA框的改变或缺失,直接影响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。
由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构,同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离,决定了起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构,这两者把酶置于一种正确的构象中,决定了识别的正确性和转录起始的正确性。
(2)、CAAT框
中心在-75处,9bp,共有序列GGT(G)CAATCT功能:与RNA聚合酶结合。(3)、GC框
在CAAT框上游,序列GGGCGG,与某些转录因子结合。CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大影响。
2、RNApolⅢ的启动子
RNApolⅢ的启动子在转录区内部。
P365图20-5由RNA聚
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