高三生物一轮复习课件【 备课精讲精研 + 能力拓展提升】 微生物的培养技术及应用

第一单元

发酵工程第一讲微生物的培养技术及应用考点分析：1阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提2阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术3举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物4概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法5概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法01预学案一、发酵工程的培养基1、培养基的概念培养基是为人工培养微生物而制备的，适合微生物等生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。①按成分组织微生物提取物牛肉膏蛋白胨取材营养配制营养成分重复性2、类型一、发酵工程的培养基①按成分准确蒸馏水成分含量可重复性繁琐较高琼脂基础特殊3．营养构成：（1）基础培养基一般含有

、

、

和

。（2）在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对

、

以及O2的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供

条件。一、发酵工程的培养基水碳源氮源无机盐pH特殊营养物质无氧一、发酵工程的培养基过滤加热补足水5.5污染1/5灭菌自然倾斜名称高压蒸汽灭菌锅100kPa121200g20g15-20g4、配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基

第一单元

发酵工程第一讲微生物的培养技术及应用二、发酵工程的无菌技术1.无菌技术：是发酵工程的重要技术之一，是指在操作过程中，保持物品与操作区域的

状态并不被

污染的技术，其核心是

。获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌微生物灭菌二、发酵工程的无菌技术比较项目消毒灭菌作用强度较为__________的物理或化学方法作用对象操作空间、操作者双手等接种环、移液管、培养基等作用结果_____杀死所有微生物(如细菌_____)能杀死物体内外的_____微生物，包括_____和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法等干热灭菌法、湿热灭菌法等温和强烈不能芽孢所有芽孢（一）主要方法——消毒与灭菌典型例题【典例2】(

)(2021·天津卷)下列操作能达到灭菌目的的是A.用免洗酒精凝胶擦手B.制作泡菜前用开水烫洗容器C.在火焰上灼烧接种环D.防疫期间用石炭酸喷洒教室C典型例题4．()下列关于灭菌和消毒的叙述，错误的是A．接种环、接种针用灼烧的方法灭菌B．灭菌是杀死物体内外所有微生物C．消毒是杀死物体内外绝大多数的微生物D．高压蒸汽灭菌的原理是使细菌DNA变性D二、发酵工程的无菌技术①应用：常用于

的玻璃器皿(如

、离心管、移液管)、

用具(如镊子、手术刀)和其他耐高温的物品(如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)的灭菌。②优点：使灭菌器皿保持

。③缺点：带有

或

的物品、液体及固体

一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。空培养皿金属干燥胶皮塑料培养基（二）发酵工程的灭菌设备

1）电热鼓风干燥箱——干热灭菌二、发酵工程的无菌技术2）高压蒸汽灭菌锅——湿热灭菌水位标记线排气阀冷空气103kPa121“0”温度典型例题【变式2】()(2021·常州前黄)下列有关使用高压蒸汽灭菌锅的操作，错误的是A.加水时，水面应与三角搁架平齐B.加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内C.加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀D.切断电源后，打开排气阀使压力表降到零后开盖D二、发酵工程的无菌技术1.培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。2.如何制备一瓶无菌水？对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。3.某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？未将锅内冷空气排尽。4.某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。二、发酵工程的无菌技术3）空气除菌设备：常采用

的方法，即让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以

空气中所含微生物。空气过滤除菌阻截三、发酵工程的无菌操作器具(1)接种器具①接种：在

条件下将微生物转入

的操作过程。②常用接种器具包括玻璃涂布器、

、接种环等。③应用：玻璃涂布器常用于

接种，接种针用于

接种，接种环用于

接种或在平板培养基上

接种。无菌培养基接种针平板稀释涂布穿刺斜面划线三、发酵工程的无菌操作器具(2)转移器具①移液管的应用：一般用于转移部分

培养物、

微生物或

化学试剂。②刻度移液管：具有

的直形玻璃管，在需要控制试剂

时使用。③微量取液器：取液量

时(如0.1mL)使用。液体系列稀释分装刻度加入量很少三、发酵工程的无菌操作器具(3)超净工作台①概念：超净工作台是一种经过

净化而形成高洁净操作环境的设备。②净化原理：是利用工作台内

的杀菌作用，并通过

过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。③注意事项：超净工作台开机杀菌30min后，需先关掉

，约

后方可使用。空气紫外线灯空气过滤器三、发酵工程的无菌操作器具(3)超净工作台①概念：超净工作台是一种经过

净化而形成高洁净操作环境的设备。②净化原理：是利用工作台内

的杀菌作用，并通过

过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。③注意事项：超净工作台开机杀菌30min后，需先关掉

，约

后方可使用。空气紫外线灯空气过滤器紫外线灯10min四、微生物接种和传代1.菌种的传代和保存要考虑菌种的

、

特性，尽量让菌种在人工创造的条件下，

细胞的代谢水平，使细胞基本处于

状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于

。2.菌种保存的重要条件：

。3.穿刺接种和斜面接种(1)厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用

接种。(2)

是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。生理生化降低休眠死亡低温、干燥、真空穿刺斜面接种四、微生物接种和传代4.菌种保存(1)临时保藏：挑选典型菌落→接种在斜面培养基上→培养使其

生长→试管用牛皮纸包扎→置于

左右的冰箱中保存(目的：减缓培养基的____

，延长

)。每隔2～3个月

接种一次，再继续保存。(2)长期保存：采用

的方法，放在

℃的冷冻箱中保存。充分4℃水分蒸发保存时间重新甘油冷冻管藏-20五、微生物的分离、纯化和培养1、菌落：由

繁殖而来的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。2、纯化微生物（获得单菌落）的方法

和

。3、原理：单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖单个或少数微生物平板划线法稀释涂布平板法1234平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。

（用于菌种分离、纯化，最终获得单个菌落）五、微生物的分离、纯化和培养五、微生物的分离、纯化和培养4、实例——纯化酵母菌湿热灭菌法平板划线法未接种倒置探究三、斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明①接种环灭菌将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次将接种环灭菌，避免污染菌种②试管口灭菌迅速将试管口通过火焰2～3次灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基③挑取菌体将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使接种环冷却，避免杀死菌种抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死探究三、斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明④接种在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管防止杂菌污染⑤培养将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28℃)中培养24h培养酵母菌，观察接种和培养的结果五、微生物的分离、纯化和培养①为什么要将平板倒置？②为什么要同时放入未接种的平板？③在琼脂平板表面多次做“由点到线”的稀释划线的目的是什么？既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。五、微生物的分离、纯化和培养a.操作第一步即取菌种之前以及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：第一次划线每次划线前划线结束目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数量减少杀死接种环上残存的菌种，避免污染环境和感染操作者5、平板划线操作的注意事项五、微生物的分离、纯化和培养b．灼烧接种环之后，要等其

后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。c．在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的

开始划线。d．划线时最后一区域不要与

相连。e．划线用力要大小适当，防止用力过大将

划破。5、平板划线操作的注意事项冷却末端第一区域培养基典型例题【变式4】()如右图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是。A．操作前要将接种环放在火焰旁灭菌B．划线操作须在火焰上进行C．在5区域中才可以得到所需菌落D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌D典型例题6．()在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图。有关叙述错误的是A．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌B．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落C．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次D．甲中a区域为划线的起始位置D稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

（用于菌种分离、计算）五、微生物的分离、纯化和培养稀释涂布平板法的操作过程——系列稀释操作101102103104105106(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复步骤2，直到第六支试管。注意：移液管需要经过灭菌，试管口和移液管应在离火焰1-2cm处稀释涂布平板法的操作过程——涂布平板操作②取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养典型例题2．()平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养D．都能在培养基表面形成单个的菌落D典型例题【变式5】()如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是A．3号试管的稀释倍数为103倍B．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个C．5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为4号试管的10倍D．该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数B（一）筛选菌株——利用选择培养基分离。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。例如：以

为唯一氮源的培养基可筛选出尿素分解菌；以

为唯一碳源的培养基可筛选出纤维素分解菌；以

为唯一碳源的培养基可筛选出石油分解菌；缺乏有机碳源的培养基可筛选出

微生物；缺乏氮源的培养基可筛选出

微生物；加入抗生素的培养基可筛选出酵母菌、霉菌等真菌。尿素纤维素石油自养固氮典型例题【典例6】（）通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出：①大肠杆菌②霉菌③放线菌④固氮细菌A．④②③B．①②③C．①③④D．③④A（二）微生物计数方法1、

（活菌计数法）①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：

a.设置

组，同一稀释度下至少涂布

个平板，排除偶然因素对实验的干扰，增强实验说服力和准确性；b.为了保证结果准确，一般选择菌落数在

的平板进行计数。c.设置对照：主要目的是排除

对实验结果的影响，例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养未接种(或接种等量无菌水)的培养基作为空白对照。③结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目

，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是

。间接计数法重复330-300杂菌少一个菌落典型例题【典例5】()用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是。A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233D（二）微生物计数方法2、显微镜直接计数法（总菌计数法）①主要用具：

和

。②血细胞计数板使用方法：先盖盖玻片，后滴培养液，再用吸水纸吸。③计算方法：每克样品中的菌株数＝小方格中细胞平均数×400×104×稀释倍数(个/mL)。注：计数时应统计方格内、相邻两边及顶角上的细胞数。④结果：估算值比实际值偏

，因为该方法不能区分细胞的死活。显微镜血球计数板或细菌计数板大典型例题(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和______供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上______色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。①分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成_______，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起______作用。菌种筛选使用以尿素为唯一______的选择培养基分离方法______________法实验流程土壤取样→__________→培养与观察菌种鉴定以尿素为唯一氮源的培养基中加入______指示剂稀释涂布平板样品稀释酚红脲酶催化氮源（三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素分解尿素的细菌脲酶PH升高变红酚红指示剂氨土壤取样→富含有机质的土壤表层土→以尿素为唯一氮源（选择培养基）→不同微生物，稀释度不同，以保证菌落数在30～300之间、适于计数的平板→培养温度30-37℃→菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等→稀释涂布平板法配制土壤溶液和培养基样品梯度稀释接种培养计数计算②实验流程（三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数02探究案1．培养基的种类探究一、培养基分类标准培养基种类培养基特点作用物理性质固体培养基外观呈固态微生物的分离、计数等半固体培养基容器放倒不致流出，剧烈振动则破散观察微生物的运动、鉴定菌种等液体培养基呈液态常用于工业生产探究一、培养基1．培养基的种类用途基础培养基含水、碳源、氮源、无机盐等最基本物质提供基本需求特殊培养基选择培养基允许特定种类的微生物生长；抑制或杀死其他微生物选择、分离鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴定、分离和筛选加富培养基加入有利于某些微生物生长和繁殖所需的特殊物质增加所需分离的微生物的数量成分来源天然培养基化学成分还不清楚适用于工业化生产合成培养基化学成分及其含量明确多用于研究和育种探究一、培养基2.几种选择培养基的设计特性主要用途设计原理加入青霉素、四环素分离酵母菌或霉菌等真菌青霉素能抑制细菌和放线菌生长，对真菌无作用不加氮源分离固氮微生物固氮微生物能利用空气中的氮气不加碳源分离自养型微生物自养型微生物能利用无机碳源探究一、培养基3.几种常用的鉴别培养基名称主要用途主要化学物质特征性变化伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌伊红、亚甲蓝出现带金属光泽的深紫色菌落刚果红培养基鉴别纤维素分解菌刚果红、纤维素纤维素被分解后出现透明圈油脂培养基鉴别产脂肪酶菌株食用油、吐温、中性红指示剂由淡红色变成深红色淀粉培养基鉴别产淀粉酶菌株可溶性淀粉淀粉被水解后出现淀粉水解圈溴甲酚紫培养基鉴别产酸微生物溴甲酚紫培养基颜色由紫色转为黄色探究一、培养基3.几种常用的鉴别培养基大肠杆菌（伊红美蓝培养基）加入刚果红的培养基加入酚红指示剂的培养基探究二、消毒和灭菌的主要方法和应用范围项目主要方法应用范围巴氏消毒法62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s～1min牛奶、啤酒、果酒和酱油等液体煮沸消毒法100℃煮沸5～6分钟家庭餐具等生活用品化学试剂灭法用适宜浓度的甲醛、氯、高锰酸钾等灭菌剂灭菌皮肤、伤口、空气、手术器械、塑料等射线灭菌波长为200～300nm的紫外线、X射线、γ射线等一般用于表面和空气的灭菌探究二、消毒和灭菌的主要方法和应用范围项目主要方法应用范围干热灭菌法干热空气灭菌：140～160℃，2～3h培养皿、接种针、移液管等火焰灼烧法接种等操作过程湿热灭菌法采用饱和蒸汽进行灭菌：121℃，100kPa，维持15～20min培养基及多种器材、物品过滤除菌法采用过滤装置除去微生物空气、料液，及在高温下不稳定的物质探究三、斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明①接种环灭菌将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次将接种环灭菌，避免污染菌种②试管口灭菌迅速将试管口通过火焰2～3次灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基③挑取菌体将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使接种环冷却，避免杀死菌种抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死探究三、斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明顺序接种操作步骤目的或分析说明④接种在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管防止杂菌污染⑤培养将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28℃)中培养24h培养酵母菌，观察接种和培养的结果探究四、微生物的纯化培养(1)原理：在培养基上将微生物

或

成

，使其长成

，这个菌落就是一个纯化的微生物菌落。稀释分散单个细胞单个菌落探究