植物组织培养7课件

第八章原生质培养和体细胞杂交主要内容植物原生质培养的目的和意义原生质分离体细胞杂交原生质体培养一、植物原生质培养的目的和意义1、原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质

据统计，目前已有49个科，160个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。

二、原生质体分离1、植物原生质体的分离方法

（1）原生质体的机械制备

（2）原生质体的酶法分离（2）Enzymaticalpreparationofprotoplasts

Basictechnique:二、影响原生质体产量和活力的因子1、材料的来源2、前处理3、酶处理4、渗透压温室或生长室栽种的植物

一般生长在下述条件下的植株能产生较好的效果:低光照强度1000lx,短日照,温度范围20-25度,相对湿度60%-80%,以及充足的氮肥供应.

禾本科和其他一些物种的叶肉细胞难以分离原生质体,因此在这些植物中一直利用培养细胞作为供体材料.2.前处理A、材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射、材料的预培养等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。龙胆试管苗只有用低温处理原生质体才能分裂；甘蔗植株只有现在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂；马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。B、消毒C、保证酶解充分进行，促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中。方法：1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中；2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真空渗入相结合。A、纤维素酶目前市场上主要有日本生产的分解细胞壁较好的纤维素酶：Onozuka、Meicelase、Driselase。纤维素酶Onozuka根据活力高低又分为P1500、P500和R-10等数种。主要含有纤维素酶C1（作用于天然的和结晶的纤维素）、纤维素酶Cx，纤维素二糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶果胶酶、脂肪酶、核酸酶、溶菌酶等。

B、半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。常用的是RhozymeHp150

C、果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。常用的果胶酶有MacerozymeR-10（离析酶，主要成分是果胶酶），此酶的活性较高，但含杂酶也较多，如使用浓度过高，时间过长，则有毒害作用。PectalyaseY-23（离析软化酶），此酶活性极高，一般叶片使用量为0.1%，悬浮细胞0.05%

原生质体分离常用的商品酶

酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA

酶浓度植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。

酶解时间\酶解温度酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40~50℃．但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。

酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，原生质体产生得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当pH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。高活性低低原生质体损坏多纤维素酶，pH5.4，果胶酶5.8，两种混合5.4~5.6

酶液pH值：4.7-5.8，常用的两种系统为①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40~0.80mmol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。

A、两步法分离植物原生质体

先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞洗涤后用纤维素酶解离细胞壁获得原生质体

B、一步法分离

把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。

三、Purificationoftheisolatedprotoplasts

酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体。所以要进行纯化。净化的方法：A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um）

B、清除较小的物质：1.沉降法2.漂浮法3.界面法1.沉降法

镍丝网滤出液置于离心管（离心2-3分钟，原生质体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液）弃去上清液再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中（反复3次）常用的清洗培养基CPW盐溶液成分（mg/l）KH2PO427.2KI0.16KNO3101.0CuSO4.5H2O0.025CaCl2.2H2O1480.0pH5.8MgSO4.7H2O246.0转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准，一般于500~800r/m的转速下离心3~5min。用吸管小心的吸掉上清液，用洗涤液洗涤三次，然后用培养基将原生质体调整到一定密度后进行培养。

2.漂浮法

根据原生质体来源不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。3.界面法原生质体纯化以柑桔为例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液Purifiedprotoplasts四、原生质体活力测定

目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。

如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。

FDA法：

伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响第三节原生质体的培养供体植物的选择原生质体的培养基培养条件培养方法细胞分裂与愈伤组织形成细胞壁的形成植株的再生影响原生质体培养的因素一、原生质体的培养基1．在多数情况下原生质体所用的基本培养基为NT，KM，DPD、MS、B52．无机盐大量元素浓度；（一般要低于愈伤组织培养基）NO3－和NH4+的比例；（降低NH4+、NO3－增加有机氮）Ca2+浓度（增加，适当的浓度，能提高分裂细胞的百分数）3．有机成分维生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，过滤灭菌）及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白

4．激素常用的激素：NAA、IAA、2,4-D（先高后低）与BA5．pH值二、培养条件

最初4-7天分离出来的原生质体应在黑暗中培养（对光很敏感，少做观察）；当细胞壁完整形成后，细胞具有耐光的特性，这时转入光下培养。

温度一般为27-29度三、原生质体培养方法1.液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。一般直径3cm加1-1.5ml培养液，6cm加2-3ml优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步生长与发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。液体浅层培养用培养基离心用培养基悬浮2.固体平板培养基也是琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在30度左右融化与原生质体融合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不容易混合均匀。3.液体-固体双层培养即在培养皿低部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。在体细胞杂交和诱发突变的研究中，最好能获得个别细胞的无性系，因此需要低密度（每毫升培养基100-500个原生质体）。

1.培养基Kao等配置了一种复杂的培养基，即KM8p培养基。2.培养方法a、饲养层培养

X-射线照射原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。

b、共培养法

将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合.

前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质.五、原生质体的发育与植株再生细胞壁再生细胞分裂与生长愈伤组织形成与分化植株再生1.细胞壁再生原生质体将失去它们特有的球形外观,这种变化被视为再生新壁的象征.一般原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁,一至数天便可形成完整的细胞壁.证明细胞壁再生的方法:

卡氏白染色（荧光增白剂，CFW）:能与细胞壁物质β-葡萄糖苷键结合,能发出荧光.电镜观察法:新形成的细胞壁是排列松散的微纤丝组成的,微纤丝的合成是发生在质膜的表面.电镜观察发现,原生质体培养数小时后,新壁开始形成,先是质膜合成形成细胞壁主要成分的微纤丝,然后转移到质膜表面进行聚合作用,产生片层的结构,以后在质膜与片层之间或在膜上产生纤微丝,逐渐形成不定向的纤维团,最后形成完整的细胞壁.细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系,凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂.2.细胞分裂与生长一般原生质体培养2-7天后,开始第一次分裂,但开始第一次分裂的时间随植物的种类,分离原生质体的材料,原生质体的质量,培养基的成分和培养条件而异.用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体；一般比用叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。3.愈伤组织形成与分化大多数情况下，原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约6周后形成直径为2mm的小愈伤组织。原生质体培养7-10天后必须及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上进一步生长。4.植株的再生原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗。然而越来越多实验证明，两步法成苗更适合大多数植物的原生质体再生植株。即首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再其转移到分化培养基上分化成苗。六、原生质体研究的趋势低密度和单个原生质体培养；原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用；单倍配子体如花粉原生质体培养；计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。第四节体细胞杂交体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起随后导致两个细胞核物质融合的技术。

理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源,这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义.Fusionphasesofoatprotoplasts(Avenasativa)A.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供有效途径;B.体细胞杂交产生的杂种,细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中，双亲的叶绿体、线粒体、DNA、亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：对称融合（asymmetricfusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetricfusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种：对称融合示意图

非对称融合的附图非对称融合示意图物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有:

核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活的目的用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)

一、融合方法PEG诱导融合法

PEG的作用机理：

由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

-+-+-桥梁++--PEG被洗掉++--电荷重排++--原生质体膜接触++-融合示意图PEG诱导融合的特点：其优点:融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点:融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

融合液：CaCl2·2H2O8~10mmol

KH2PO40.7mmol

甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol

pH5.6

诱导液：融合液＋PEG20～45％

稀释液：A液（g/100ml）pH6.0

B液（g/100ml）pH10.5

葡萄糖7.21甘氨酸0.375

CaCl2·2H2O0.79NaOH0.169

DMSO（二甲亚砜）10mlP1融合液P2混合静止1min.选择P1P2加入PEG培养融合加入稀释液加入培养基稀释洗涤2、电融合法

1979年：Senda首先实现原生质体融合

交流电使原生质体排成串珠

直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。

电融合仪的结构特点：

一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。电融合的基本过程：

细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。电融合法原理交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠+

-+

-+

-+

-+

-+

-负极正极+-+-+-+-+-施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-二、原生质体融合的过程包括3个主要阶段：1、凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；2、在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；3、由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。三、影响原生质体融合的因素首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。其次，融合方法首选电融合、如果没有条件进行电融合，可以考虑PEG融合其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。原生质体融合后的培养同原生质体培养四、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定

1、杂种细胞的筛选原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1）亲本

2）同核体：同源原生质体的融合体3）异核体：非同源的原生质体的融合体4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体

5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。

6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体植物细胞筛选方式1）遗传互补筛选法：

利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法：

根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。

亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记

亲本2：碱性蕊香红荧光素标记

在荧光显微镜下，亲本1为绿色，亲本2为红色色，杂种细胞可以区分

4）利用生长特性筛选法：

利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。2、体细胞杂种的鉴定

形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。

细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。

生化鉴定：同功酶鉴定。

分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。

2-1、形态学

比较再生植株与融合亲本在形态上的异同

2-2、细胞学

染色体形态和数目的比较18条染色体36条染色体五、体细胞杂种的特点形态上的趋中性变异幅度大非整倍性双亲性状的共显性偏亲现象六、体细胞杂种的遗传特性