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微生物学第七章微生物遗传与变异第1页,共85页,2023年,2月20日,星期四Contents遗传变异的物质基础1基因突变和诱变育种2基因重组和杂交育种3基因工程45菌种的衰退、复壮和保藏5第2页,共85页,2023年,2月20日,星期四第一节遗传变异的物质基础一、三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质(一)转化实验(1928年,Griffith)1、实验材料:肺炎双球菌(Streptococcuspneumoniae

)光滑型(S)粗糙型(R)有荚膜菌落光滑分泌毒素致病无荚膜菌落粗糙无毒不致病第3页,共85页,2023年,2月20日,星期四S型R型第4页,共85页,2023年,2月20日,星期四转化实验(1)动物实验2、方法第5页,共85页,2023年,2月20日,星期四转化实验(2)细菌培养实验热死S菌—————不生长

活R菌—————长出R菌

热死S菌—————长出大量R菌和10-6S菌+活R菌平皿培养第6页,共85页,2023年,2月20日,星期四转化实验(3)S型菌无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌第7页,共85页,2023年,2月20日,星期四①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty,1944第8页,共85页,2023年,2月20日,星期四(二)噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase,1952年DNA含P不含S,

Pr含S不含P。第9页,共85页,2023年,2月20日,星期四(三)植物病毒的重建实验H.Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡,就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。第10页,共85页,2023年,2月20日,星期四第11页,共85页,2023年,2月20日,星期四TMVHRVHRVTMV原始株拆开重建感染分离纯化第12页,共85页,2023年,2月20日,星期四结论核酸是负载遗传信息的真正物质基础第13页,共85页,2023年,2月20日,星期四(二)原核生物的质粒1、质粒的定义和特点定义:指游离于原核生物核基因组以外,具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子,即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。第14页,共85页,2023年,2月20日,星期四特点(1)超螺旋结构;(2)携带某些核基因组上所缺少的特殊功能的基因;(3)独立存在于细胞内的复制子;(4)当用一些理化因素处理时,可使子代细胞中的质粒消除;(5)某些质粒可与核染色体发生整合或脱离—附加体;(6)质粒与质粒间、质粒与染色体之间具有重组功能;(7)有些质粒不表现任何功能—隐蔽性质粒。第15页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、质粒的种类按其功能划分:(1)接合性质粒:如F质粒;(2)抗药性质粒:如R质粒;(3)产细菌素的质粒:如Col质粒;(4)具有生理功能的质粒:如固氮的mega质粒、降解性质粒等;(5)产毒质粒:如Ti质粒。第16页,共85页,2023年,2月20日,星期四第二节基因突变和诱变育种一、基因突变(genemutation)基因突变简称突变,泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化,可自发或诱导产生。(野生型、突变型)突变率:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数第17页,共85页,2023年,2月20日,星期四(一)突变的类型按是否在选择性培养基上比较容易、迅速地分离和鉴别来分:突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型第18页,共85页,2023年,2月20日,星期四(二)突变的特点1、稀有性:突变率低;2、独立性:各种突变独立发生,不会互相影响;3、可诱变性:诱变剂可提高突变率;4、稳定性:变异性状稳定,可遗传;5、可逆性:正向突变;回复突变或回变;6、自发性:突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生;7、不对应性:突变的性状与引起突变原因之间无直接的对应关系。第19页,共85页,2023年,2月20日,星期四(三)基因突变的机制突变诱变自发突变基因突变染色体畸变:缺失、重复、易位、倒位碱基置换移码突变转换颠换缺失添加第20页,共85页,2023年,2月20日,星期四1、诱发突变(inducedmutation)诱发突变:指通过人为的方法,利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。简称诱变。诱变剂:凡具有诱变效应的任何因素。第21页,共85页,2023年,2月20日,星期四(1)碱基置换转换:嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换;颠换:嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换。第22页,共85页,2023年,2月20日,星期四(2)移码突变诱变剂使DNA序列中一个或少数几个核苷酸增添或缺失,从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变,引起转录和转译错误的突变;第23页,共85页,2023年,2月20日,星期四(3)染色体畸变某些强烈理化因子,如电离辐射(X射线等)和烷化剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤。第24页,共85页,2023年,2月20日,星期四若干诱变剂的作用机制及诱变功能诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟胺 与胞嘧啶起反应 GC→AT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换 交联 缺失 烷化剂 烷化碱基(主要是G) AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 AT→TA的颠换 丧失烷化的嘌呤 GC→CG的颠换 糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤(缺失、重复、倒位、易位) 丫啶类 碱基之间的相互作用(双链变形) 码组移动(+或-) 紫外线 形成嘧啶的水合物 GC→AT转换 形成嘧啶的二聚体 码组移动(+或-) 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换

DNA降解 码组移动(+或-) 糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤(缺失、重复、倒位、易位) 丧失嘌呤

加热 C脱氨基 CG→TA转换

Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动 第25页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、自发突变(spontaneousmutation)自发突变:是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。原因:(1)由背景辐射和环境因素引起;(2)由微生物自身有害代谢物引起;(3)由DNA复制过程中碱基配对错误引起等;(4)转座(Indel诱变假说)。第26页,共85页,2023年,2月20日,星期四(四)紫外线对DNA的损伤及其修复1、损伤机制紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,影响DNA的复制和转录,从而引起突变或使细胞死亡。第27页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、修复机制(1)光复活作用经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时,可明显降低其死亡率的现象,称为光复活作用。(光解酶)第28页,共85页,2023年,2月20日,星期四(2)切除修复(暗修复)是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂(包括烷化剂、X射线和γ射线等)损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。第29页,共85页,2023年,2月20日,星期四二、突变与育种(一)自发突变与育种(二)诱变育种指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,在促进其突变率显著提高的基础上,采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选出少数符合目的的突变株,以供科学试验或生产实践使用。第30页,共85页,2023年,2月20日,星期四1、诱变育种的基本环节第31页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、诱变育种的原则(1)选择简便有效的诱变剂;(2)挑选优良的出发菌株;(3)处理单细胞或单孢子悬液;(4)选用最适的诱变剂量;(5)充分利用复合处理的协同效应;(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标;(7)设计高效筛选方案;(8)创造新型筛选方法。第32页,共85页,2023年,2月20日,星期四Amestest理论依据:一切生物的遗传物质基础都是核酸,所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物的“三致”(致突变、致畸变、致癌变)物质可引起核酸结构的改变,从而引起其功能的改变。基本原理:Salmonellatyphimurium

的his-菌株在[-]的平板上不能生长,如发生回复突变,则能生长。第33页,共85页,2023年,2月20日,星期四第34页,共85页,2023年,2月20日,星期四春日霉素产生菌的孢子悬液

诱变涂布平板培养2天(29℃)培养4-5天(29℃)生物鉴定板上含供试菌种培养17-18小时(29℃)检查抑菌圈的大小(1)产量突变株的筛选3、3类突变株的筛选方法第35页,共85页,2023年,2月20日,星期四(2)抗药性突变株的筛选第36页,共85页,2023年,2月20日,星期四(3)营养缺陷型突变株的筛选①与筛选营养缺陷型有关的三类培养基基本培养基(minimalmidium,MM)—[-];完全培养基(completemedium,CM)—[+];补充培养基(supplementalmedium,SM)—[A]②与营养缺陷型突变有关的菌体野生型(wildtype)—能在[-]中生长;营养缺陷型(auxotroph)—能在[+]或[A]生长;原养型(prototroph)—能在[-]中生长。第37页,共85页,2023年,2月20日,星期四③营养缺陷型突变株的筛选方法抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株(出发菌株)诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿逐个检出法影印接种法生长谱法第38页,共85页,2023年,2月20日,星期四抗生素法第39页,共85页,2023年,2月20日,星期四菌丝过滤法第40页,共85页,2023年,2月20日,星期四夹层培养法第41页,共85页,2023年,2月20日,星期四逐个检出法第42页,共85页,2023年,2月20日,星期四影印接种法第43页,共85页,2023年,2月20日,星期四营养缺陷型的鉴定——生长谱法无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液(107-108/ml)0.1ml[-].[+]培养第44页,共85页,2023年,2月20日,星期四举例——枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出(影印培养法)(使细胞处于对数生长期)(UV照射60s)(调整细胞浓度为108个/ml)(30度振荡过夜培养)(青霉素法)第45页,共85页,2023年,2月20日,星期四第三节基因重组和杂交育种基因重组的定义:两个独立基因组内的遗传基因,通过一定的途径转移到一起,形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组,简称重组。第46页,共85页,2023年,2月20日,星期四一、原核生物的基因重组(一)转化(transformation)1、定义:受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的重组细胞称为转化子。2、影响菌株间发生转化的因素①与它们在进化过程中的亲缘关系有关;②最易与细胞表面结合的是dsDNA;③转化需要的最低DNA浓度极低(10-5µg/ml);④发生转化的细胞必须处于感受态(受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态)。第47页,共85页,2023年,2月20日,星期四3、转化过程第48页,共85页,2023年,2月20日,星期四4、转染(transfection)用提纯的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主细胞,可增殖出一群正常病毒后代的现象称为转染。与转化的区别:①病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌;②中间不发生任何遗传因子的交换或整合;③最后不产生具有杂种性质的转化子。第49页,共85页,2023年,2月20日,星期四(二)转导(transduction)定义:通过缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中,通过交换与整合,使后者获得前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞称为转导子。第50页,共85页,2023年,2月20日,星期四1、普遍转导(generalizedtransduction)定义:通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何DNA小片段的“误包”,而将其遗传性状传递给受体菌的现象。第51页,共85页,2023年,2月20日,星期四(1)完全普遍转导(generalizedtransduction)第52页,共85页,2023年,2月20日,星期四(2)流产普遍转导第53页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、局限转导(restrictedtransduction)定义:通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中,并与后者的基因组整合、重组,形成转导子的现象;第54页,共85页,2023年,2月20日,星期四(1)低频转导(LFT)定义:指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导,引起只能形成极少数(10-4~10-6)转导子,故称低频转导。第55页,共85页,2023年,2月20日,星期四(2)高频转导(HFT)定义:局限转导中,若对双重溶源菌进行诱导,就会产生含50%左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物,用这种裂解物去转导受体菌,可获得高达50%左右的转导子,故称高频转导。双重溶源菌:同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌。双重溶源菌被紫外线等诱导时,正常的噬菌体(如)具有补偿缺陷噬菌体(如

dgal)所缺失的部分基因的功能,使两种噬菌体同时获得复制;存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体。第56页,共85页,2023年,2月20日,星期四3、溶源转变(lysogenicconversion)当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时,因噬菌体基因整合到宿主基因上,而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象,称溶源转变。第57页,共85页,2023年,2月20日,星期四与转导区别:①不携带来任何外源基因的正常噬菌体;②是噬菌体基因而不是供体菌基因提供了宿主新性状;③新性状是宿主细胞溶源化时的表型,而不是经遗传重组形成的稳定转导子;④获得的新性状随噬菌体的消失而同时消失。第58页,共85页,2023年,2月20日,星期四(三)接合(conjugation)1、定义:供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触,把F质粒或其携带的核基因组传递给后者,使后者获得若干新遗传性状的现象。通过结合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。第59页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、大肠杆菌的四种接合型菌株(1)F+(“雄性”)菌株指细胞内含有一至几个F质粒,并在细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F–相接触时,可通过性菌毛将F因子转移到F–菌株中,使之也变成F+菌株。(2)F–(“雌性”)菌株指细胞中无F质粒,细胞表面也无性毛的菌株。可以通过与F+、F’或Hfr菌株接合而接受供体菌的F质粒、F’因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息,相应地可以转变成F+菌株、F’菌株或含有一系列Hfr菌株遗传性的重组子。第60页,共85页,2023年,2月20日,星期四(3)Hfr(高频重组菌株,highfrequencyrecombination)含有与染色体特定位点整合的F质粒。Hfr菌株与F–菌株接合时,Hfr染色体双链中的一条单链在F质粒处断裂,整段单链线状染色体从5’端开始等速进入F–细胞,在没有外界干扰的情况下,全部转移过程的完成需要约100分钟。由于种种原因DNA转移过程常会发生中断,所以越是前端的基因进入F–细胞的机会越大。F质粒决定性别的基因位于线状DNA的末端,进入受体细胞的机会最小,故这种接合引起转性的频率最低,但可以出现各种重组子。第61页,共85页,2023年,2月20日,星期四中断实验:接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性,在接合进行中采用定时人为中断的方法,可以获得呈现不同数量Hfr性状的F–

接合子,据此,可以选定几种有特定整合位点的Hfr菌株,使之与F–菌株进行接合,并在不同时间使其中断,最后,根据F–中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序(分钟),可以绘出较为完整的环状染色体图(chromosomemap)。第62页,共85页,2023年,2月20日,星期四(4)F’菌株细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F质粒,可与F–菌株接合,称为F’菌株。F’菌株的形成:由Hfr菌株中的F质粒在不正常切离而脱离核染色体组时所形成。由Hfr异常释放所生成的F’菌株称为初生F’菌株;由F–接受外来F’因子所产生的F’菌株叫作次生F’菌株。F因子转导(F-mediatedtransduction):以F’质粒来传递供体基因的方式。又称性导。第63页,共85页,2023年,2月20日,星期四3、F质粒的4种存在方式及相互关系第64页,共85页,2023年,2月20日,星期四大肠杆菌的接合方式F+×F-

F++F+

Hfr×F-

Hfr+F-Hfr×F-

Hfr+

HfrF’×F-

F’+F’第65页,共85页,2023年,2月20日,星期四第66页,共85页,2023年,2月20日,星期四第67页,共85页,2023年,2月20日,星期四第68页,共85页,2023年,2月20日,星期四(四)原生质体融合(protoplastfusion)1、定义:通过人为的方法,使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合,借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。2、原生质体融合的特点(1)重组频率高;(2)不受亲缘关系的影响;(3)能转移多数基因,可获得生产性状更为优良的新物种;(4)两个原生质体表面直接接触,对等融合形成(双向转移)。第69页,共85页,2023年,2月20日,星期四3、原生质体融合的主要步骤(1)选择亲本:有特殊价值;有选择性遗传标记。(2)获得原生质体:脱壁酶去除细胞壁(细菌、放线菌、真菌)。(3)原生质体融合:促融合剂PEG(聚乙二醇)或电脉冲。(4)筛选稳定的融合子。第70页,共85页,2023年,2月20日,星期四第71页,共85页,2023年,2月20日,星期四第72页,共85页,2023年,2月20日,星期四二、真核微生物的基因重组(一)有性杂交1、定义:指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组,进而产生新遗传型后代的一种育种技术。第73页,共85页,2023年,2月20日,星期四2、举例—酿酒酵母酒精酵母:产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱;面包酵母:产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强。亲本的单倍化↓有性杂交↓杂交后代的检出↓筛选优良性状个体酵母菌有性杂交程序第74页,共85页,2023年,2月20日,星期四(二)准性杂交(parasexualhybridization)1、准性生殖:同种两个不同菌株的体细胞发生融合,且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。2、准性生殖过程(1)菌丝联结:频率低;(2)形成异核体:质配;(3)核融合:

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