临床分子生物学检验

绪论1.20世纪50年代，Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起。从广义上来讲，应用到临床的分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物，目前，临床分子生物学检验的靶标主要以核酸（DNA或RNA）为主。第一章：核酸与分子标志物1.分子标志物：可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。核酸分子标志物是分子生物学检验的主要内容，包括基因突变、DNA多态性、基因组DNA片段、RNA和循环核酸等多种形式。2.DNA的组成：是一种高分子化合物，其基本单位是脱氧核苷酸，每个核苷酸由磷酸、脱氧核糖和含氮碱基3部分组成。3.DNA与RNA的区别：2位脱氢。4.DNA的结构：①DNA一级结构：各种核苷酸单体沿多核苷酸链排列的顺序，表明该DNA分子的化学构成。②DNA二级结构：双螺旋结构，DNA双螺旋的直径为2nm,一圈螺旋含10个碱基对，每一圈螺距为3.4nm，每个碱基的旋转角度为36度。维持DNA结构稳定的力量主要是碱基对之间的堆积力，碱基对之间的氢键也起着重要的作用。③DNA三级结构：DNA双螺旋进一步盘曲形成的更加复杂的结构。核小体的形成（真核生物染色体包装过程）：在核小体中,DNA盘绕组蛋白八聚体核心,使DNA缩短为原来的1/7；6个核小体形成螺丝管，缩短为1/6；核小体彼此相连成串珠状染色质细丝，螺旋化形成染色质纤维，进一步折叠成染色单体。DNA双螺旋结构的变异：右手螺旋A-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、H-DNA、L-DNA、P-DNA，左手螺旋Z-DNARNA主要分为三类:tRNA、rRNA、mRNA还有一些小型RNA：反义RNA、微小RNA（microRNA,miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。）真核mRNA与原核mRNA的区别（简答题）原核mRNA结构简单，为多顺反子，编码序列之间有间隔序列，原核生物mRNA中没有修饰碱基。真核生物mRNA为单顺反子结构，成熟的mRNA中5’端有帽子结构，3’端有polyA尾巴。原核生物主要的rRNA（占细胞总RNA80%）有三种：5S、16S、23S；真核生物有四种5S、5.8S、18S和28SrRNA基因：能编码有功能的蛋白质多肽链或合成RNA所必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能单位。顺式调节：一个基因的调控区和结构基因位于同一DNA分子的相邻部位，其作用是参与基因表达的调控。启动子：一段位于结构基因5’端的上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。操纵序列（操纵元件）可被具有抑制转录作用的阻遏蛋白识别并结合12.真核生物基因结构包括外显子和内含子，称为断裂基因13.增强子：可位于基因的上游或下游，也可位于内含子中，它不能启动一个基因的转录，但有增强转录的作用14:表观遗传：在DNA序列不发生改变的情况下，基因功能出现可逆的、可遗传的变化。包括组蛋白修饰（包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化）、DNA甲基化、RNA干扰等。DNA甲基化：生物体在DNA甲基转移酶的催化下，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化一般发生在CG双核苷酸的C上面。16.基因突变类型：点突变、插入缺失、动态突变17.错义突变：点突变改变了三联体密码子，导致基因产物中某个氨基酸被另一个氨基酸所取代。18.无义突变（链终止突变）：DNA序列的改变使得编码某一氨基酸的密码子突变终止密码，则导致翻译过程提前终止。19.基因组：一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA20.原核生物基因组特征：基因组较小没有典型的细胞核结构操纵子结构是原核生物基因组的功能单位原核生物的结构基因中无内含子成分，不需要经过剪接加工过程具有编码同工酶的基因含有可移动DNA序列质粒：指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。转座因子（转座元件）：是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。包括插入序列、转座子、Mu噬菌体病毒基因组类型：人类基因组包括：细胞核内的核基因组和细胞质内的线粒体基因组。人类基因组的最大特征：存在大量的非编码序列和重复序列多基因家族：由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。假基因：在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因。多态性：不同的个体之间，在基因组DNA序列上会存在差异，平均而言，一对同源染色体每1000个碱基就会出现一个碱基的差异(基因组中蛋白质编码区大概是每2500个碱基出现一个差异)。当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1%时，则成为多态性。人类基因组多态性形式：限制性片段长度多态性小卫星和微卫星多态性单核苷酸多态性拷贝数多态性30.单核苷酸多态性：在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性：核酸杂交技术核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。核酸分子杂交的基本原理：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，DNA分子成为单链；将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，变性DNA只要消除变性条件，有碱基互补区域的单链又可以重新结合成双链，形成异源核酸分子的双链结构。复性：变性DNA只要消除变性条件，有碱基互补区域的单链又可以重新结合成双链，这一过程称作复性。码逆转录蛋白）、env基因（编码包膜前体蛋白）6个调控基因：tat、rev、nef、vif、vpr、vpu/vpx等。流感病毒的遗传物质：单股负链RNA人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，流感病毒的遗传物质是单股负链RNA：单基因遗传病的分子生物学检验人类的单基因遗传病的主要遗传方式分为三种：常染色体遗传、X连锁遗传、Y连锁遗传。单基因遗传病分子生物学检验的策略包括直接和间接诊断策略直接诊断策略：直接揭示导致遗传病发生的各种遗传缺陷，即用分子生物学技术直接检出致病基因的突变或由于结构变化与转录异常导致的基因的表达量的改变等遗传缺陷。镰状细胞贫血发生的分子机制：镰状细胞贫血患者由于β珠蛋白基因中第6位密码子存在单个碱基的突变，由原来的GAG变成GTG，使谷氨酸变成缬氨酸，导致氧结合能力过低，红细胞发生镰变。：肿瘤分子生物学检验肿瘤相关的基因：原癌基因、肿瘤抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因、维持细胞基因组稳定基因、肿瘤转移相关基因、肿瘤血管生成相关基因原癌基因：人类固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。原癌基因激活机制包括：插入激活、基因重排（染色体异位）、基因点突变（移码突变）、基因扩增、基因转录改变抑癌基因：可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白质的基因，正常情况下负责控制细胞的生长和增殖。血液基因组提取苯酚/氯仿作用：对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA却没有影响，经苯酚/氯仿抽提后，苯酚/氯仿层与水相完全分层，蛋白质变性而被离心沉淀降到苯酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于苯酚/氯仿，从而与水相分离得以去除。异丙醇：沉淀RNA加入苯酚/氯仿后离心，分为三层分别是：水、变性的蛋白质、有机溶剂（氯仿）。电泳结果分析：动物组织总RNA的提取及鉴定电泳A．结果分析：B.电泳方向：负极泳动到正极（RNA带负电）。C.电泳中分子量大跑的慢D.上样缓冲液LoadingBuffer成分：蔗糖（增加样品质量）、溴酚蓝（指示电泳过程）溴化乙锭EB作用：结合核酸，紫外光下变红注意事项：a.为防止RNA酶污染，要对试剂RNA酶处理，戴手套b.若RNA降解，重新提取OD260nm=1时DNA=50ng