基因工程原理 动物细胞的基因转移

动物细胞的基因转移

1现在是1页\一共有41页\编辑于星期三Introduction动物细胞的基因转移已应用了40多年研究基因功能和调控或者生产大量的重组蛋白哺乳动物细胞系，杆状病毒表达系统体内基因治疗不同于转基因动物2现在是2页\一共有41页\编辑于星期三动物细胞基因转移的策略直接DNA转移

显微注射，基因枪转染技术

利用化学和物理技术诱导细胞从外界环境摄取DNA病毒介导——转导细菌介导——细菌感染3现在是3页\一共有41页\编辑于星期三转染技术化学方法

（不同的方法有相似的原理）DNA/磷酸钙共沉淀法

其他化学方法

脂质体转染物理方法

（有多样的机制）

电穿孔，显微注射，基因枪4现在是4页\一共有41页\编辑于星期三DNA/磷酸钙共沉淀法HPRT缺陷型的细胞DNA/磷酸钙共沉淀为复合物，积累到细胞膜上，然后再由细胞摄取到内部，并转运到细胞核，DNA释放并得到表达沉淀物要现用现配沉淀物必须包裹细胞，只适用于单层生长的细胞，而不适用悬浮或成团生长的细胞转染效率低5现在是5页\一共有41页\编辑于星期三6现在是6页\一共有41页\编辑于星期三其他的化学转染方法二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚阳离子糖类，可以促进DNA与胞吞相互作用瞬时转染效率很高，但不能形成稳定转化的细胞系7现在是7页\一共有41页\编辑于星期三脂质体转染Lipofection(liposometransfection)将DNA包装到一个磷脂泡囊中，泡囊可以与靶细胞的细胞膜相互作用，促进DNA摄取。适用于多种细胞类型，包括悬浮细胞可以转染大片段DNA，比较温和转染效率高达90%可用于基因治疗8现在是8页\一共有41页\编辑于星期三Lipofection9现在是9页\一共有41页\编辑于星期三10现在是10页\一共有41页\编辑于星期三电穿孔法细胞置于短暂的电脉冲中使细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔，DNA通过这些孔进入细胞并转运到核。适用于多种类型的细胞确定电脉冲的强度和持续时间参数确定后，具有高重复性需要的细胞量比较大，容易引起死亡11现在是11页\一共有41页\编辑于星期三单细胞转染新技术：纳米钢笔探针电穿孔12现在是12页\一共有41页\编辑于星期三直接转化的方法显微注射13现在是13页\一共有41页\编辑于星期三基因枪14现在是14页\一共有41页\编辑于星期三瞬时转染和稳定转染瞬时转染：转入的DNA不能被细胞所整合，DNA在核中保持外源染色体状态，也不包含在宿主细胞中可以发挥功能的复制起始位点，那么它只能保留很短的时间就会稀释或者降解。稳定转染：DNA整合到基因组中，形成新的遗传位点，并遗传给所有的无性繁殖后代。15现在是15页\一共有41页\编辑于星期三共转染和稳定转染的筛选动物细胞的选择标记内源选择标记（依赖突变体）共转染显性选择标记16现在是16页\一共有41页\编辑于星期三TK可用作内源选择标记17现在是17页\一共有41页\编辑于星期三常用的内源选择标记基因现在是18页\一共有41页\编辑于星期三共转染物理上不相连的DNA进行转染，都会整合到基因组中。利用了解清楚的质粒与目的基因共转染，已知的筛选标记筛选，Southern鉴定目的基因。不相连的供体DNA片段在整合之前发生了融合。19现在是19页\一共有41页\编辑于星期三显性选择标记内源标记的缺陷：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞系。显性选择标记所提供的表现型对于细胞来说是全新的，因此可以用于任何类型的细胞。20现在是20页\一共有41页\编辑于星期三21现在是21页\一共有41页\编辑于星期三选择标记和转化基因的扩增添加药物筛选后，少数个别细胞会自发产生抗药性突变而存活氨甲喋呤，DHFR，dhfr“假阳性”的去除：强启动子驱动dhfr，引入第二个选择标记22现在是22页\一共有41页\编辑于星期三DNA介导的基因转移质粒载体23现在是23页\一共有41页\编辑于星期三质粒载体进行转染的优点质粒载体的方便性得以在动物细胞中应用质粒上的调控序列可以驱动目的基因的表达质粒上的选择标记和目的基因会一起整合到基因组，不需要与其他基因共转染穿梭载体的使用，使载体保持为游离的复制子24现在是24页\一共有41页\编辑于星期三用于瞬时转化的非复制型质粒载体瞬时转化时经常使用质粒载体目的就是利用染色体外DNA的短期存在性基因表达的瞬时测定和重组蛋白的适量回收在大多数动物细胞中共价闭合环状DNA只能保持1~2天。25现在是25页\一共有41页\编辑于星期三复制子载体的转染失控的多瘤病毒复制子BK和BPV复制子的稳定转化EBV复制子的稳定转化26现在是26页\一共有41页\编辑于星期三失控的多瘤病毒复制子多瘤病毒会造成溶解感染，即病毒基因组复制出非常高的拷贝数，从而使细胞裂解，释放出成千上万的子代病毒颗粒。利用其复制起点和启动子构建克隆载体，瞬时转染，大量生产重组蛋白27现在是27页\一共有41页\编辑于星期三SV40病毒载体SV40有约5kb的环状双链DNA基因组最初的SV40载体是病毒载体病毒外壳最大只能插入2.5kb的外源DNA28现在是28页\一共有41页\编辑于星期三SV40质粒载体携带有SV40复制起点的质粒与病毒本身具有同样的作用将SV40复制起点克隆到大肠杆菌载体上T抗原编码区整合鼠多瘤病毒复制起始位点人巨细胞病毒启动子29现在是29页\一共有41页\编辑于星期三BK和BPV复制子的稳定转染BK病毒和EBV病毒会导致潜伏性感染，病毒基因组保持在低或中等的拷贝数，从而不会影响宿主细胞的生长。稳定转染效率等于普通瞬时转染的效率提供BKT抗原后，含有BK复制起点的质粒载体就会像病毒一样进行复制引入neo等选择标记后，逐步提高培养基中抗生素的浓度，就可以筛选高拷贝的细胞30现在是30页\一共有41页\编辑于星期三31现在是31页\一共有41页\编辑于星期三BPV载体32现在是32页\一共有41页\编辑于星期三EBP载体33现在是33页\一共有41页\编辑于星期三腺病毒DNA病毒，基因组大约36kb6个早期转录子，1个主要的后期转录子稳定性、外源DNA高容量、宿主范围广、高滴度后代34现在是34页\一共有41页\编辑于星期三腺病毒相关载体AAV单链DNA病毒对异源辅助病毒有依赖性AAV载体已用于将基因高效转入许多类型的细胞35现在是35页\一共有41页\编辑于星期三杆状病毒杆状病毒具有杆状的衣壳和大的dsDNA基因组感染许多节肢动物，特别是昆虫。主要用于在昆虫和昆虫细胞内的高水平瞬时蛋白表达AcMNPV和BmNPVsf9，sf21家蚕活体36现在是36页\一共有41页\编辑于星期三37现在是37页\一共有41页\编辑于星期三38现在是38页\一共