基因敲除干扰

基因敲除干扰第1页，共54页，2023年，2月20日，星期四“Knockout”“Transgenic”“Transgenic”:anorganismthathashadDNAintroducedintooneormoreofitscellsartificiallyDNAisintegratedinarandomfashionbyinjectingitintothepronucleusofafertilizedovumRandominsertion-Oftenmultiplecopies“knockout”:DNAisintroducedfirstintoembryonicstem(ES)cells.EScellsthathaveundergonehomologousrecombinationareidentifiedandinjectedintoa4dayoldmouseembryo-ablastocysttargetedinsertion-singlecopy第2页，共54页，2023年，2月20日，星期四TRANSGENICPRODUCTIONTransgenicmiceareoftengeneratedto 1.characterizetheabilityofapromotertodirecttissue-specificgeneexpressione.g.apromotercanbeattachedtoareportergenesuchasLacZ(Beta-galactosidase)orGFP(GreenFluorescentProtein)2.examinetheeffectsofover-expressingandmis-expressingendogenousorforeigngenesatspecifictimesandlocationsintheanimalsPromoterofgeneofinterestLacZreportergenePromoterofgeneofinterestcDNAcopyofgeneofinterest第3页，共54页，2023年，2月20日，星期四Trangenicmouseembryoinwhichthepromoterforageneexpressedinneuronalprogenitors(neurogenin1)drivesexpressionofabeta-galactosidasereportergene.Neuralstructuresexpressingthereportertransgenearedarkblue-green.(Dr.AnneCalof)Neurogenin1promoterLacZreportergene第4页，共54页，2023年，2月20日，星期四Tailtip9.5dayembryosGFPandwtGFPTRANSGENICMOUSE第5页，共54页，2023年，2月20日，星期四基因敲除主要是在胚胎干细胞(embryonicstemceils，ESC)水平进行操作。胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系，在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖，在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可以在整个生物体内实现预期的基因改变。基因敲除第6页，共54页，2023年，2月20日，星期四VECTORDESIGNRecombinantDNAmethods:SimpleKOStructuralgenedesired(e.g.Cyp2E1)tobe"knockedout"isreplacedpartlyorcompletelybyapositiveselectionmarker.(knockoutfunction!)VectorDNAtoenablethemoleculestobeinsertedintohostDNAmoleculesHSV-TKNeomycinresistancegene(positiveselection)HerpessimplexvirusThymidineKinase(negativeselection)ResistanttoneomycinSensitivetoganciclovir第7页，共54页，2023年，2月20日，星期四PreparationofEmbryonicStemCellsHarvestedfromtheinnercellmassofmouseblastocystsGrownincultureandretaintheirfullpotentialtoproduceallthecellsofthematureanimal,includingitsgametes第8页，共54页，2023年，2月20日，星期四SELECTINGESCELLSWITHKO第9页，共54页，2023年，2月20日，星期四INJECTINGFERTILIZEDEGGSTheeggsareharvested0.5dpc(superovulatedornaturalmatings)TheDNAisusuallyinjectedintothemalepronucleusTheeggscanbetransferredthesamedayorthenext(2-cell)intopseudo-pregnantfemaleoviducts第10页，共54页，2023年，2月20日，星期四SUCCESSFULLYTRANSFORMEDESCELLSAREINJECTEDINTOBLASTOCYSTS第11页，共54页，2023年，2月20日，星期四PSEUDOPREGNANTFEMALESANDVASECTOMIZEDMALESFemalemicecanbetrickedintothinkingtheyarepregnantAmouseinestrusismatedwithavasectomizedmalepseudopregnancyIfeggs(blastocysts)implantedwillbecometrulypregnantandwillgivebirthtoliveoffspring第12页，共54页，2023年，2月20日，星期四Generalprocedureforproducinggene-targetedknockoutmice.

EScellsheterozygousforaknockoutmutationinageneofinterestandhomozygousforamarkergene(e.g.blackcoatcolor)aretransplantedintotheembryosthatarehomozygousforanalternatemarker(e.g.whitecoatcolor).Theearlyembryosthenareimplantedintoapseudopregnantfemale.Someoftheresultingprogenyarechimeras,indicatedbytheirblackandwhitecoats.ChimericmicethenarebackcrossedtowhitemiceblackprogenyfromthismatinghaveES-derivedcellsintheirgermline.ByisolatingDNAfromtailtissue,it’spossibletoidentifyblackmiceheterozygousfortheknockoutallele.Intercrossingoftheseblackmiceproducesknockoutmice.第13页，共54页，2023年，2月20日，星期四OFFSPRING-CHIMERICFOUNDERSBlackmouse-noapparentEScellcontributionChimericfounder-strongEScellcontributionChimericfounder-weakerEScellcontributiongerm-linetransmission-usuallytheEScellsarederivedfroma129strain(agoutiorwhitecolour)andtheEScellsareinjectedintoaC57Bl/6blastocyst(black).ThemorethattheEScellscontributetothegenomeofthemouse,themorethecoatcolourwillbeagouti.Thechimeramouseisusually“tiger”striped.第14页，共54页，2023年，2月20日，星期四小分子RNA---生命科学的新宠第15页，共54页，2023年，2月20日，星期四人类对生命的探索第16页，共54页，2023年，2月20日，星期四垃圾DNA!JunkDNA，

GeneticWasteland

Non-codingSequence当然不是！Surenot!第17页，共54页，2023年，2月20日，星期四小RNA的发现WhyItGotLostintheShuffleforsolong世纪钻石小分子RNA研究,摘取2002年度SCIENCE十大发现第一名的桂冠第18页，共54页，2023年，2月20日，星期四小RNA的研究为什么沉寂多年？

WhyItGotLostintheShuffleforsolong1969年，BrittenandDavidson预测：真核细胞中基因表达的开关与RNA的识别直接联系2001年前:德国学者另辟蹊径，专门从事对

“垃圾基因”的研究，提出了“RNA组学的概念”同时,加拿大学者Mattick认为非编码RNA是决定基因复杂调控的关键网络分子第19页，共54页，2023年，2月20日，星期四精彩纷呈的ＲＮＡ世界miRNAandsiRNAsiRNAandmiRNA的发现过程；作用的方式和差别；miRNA的功能研究第20页，共54页，2023年，2月20日，星期四1990年：2个研究组报道了正义RNA具有“共抑制”现象SiRNA的发现Petunia牵牛花第21页，共54页，2023年，2月20日，星期四1998年:第一次在线虫中证实dsRNA,

在抑制基因表达中的功能Neg.controlUninjectedAntisenseRNA

dsRNANature1998391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization第22页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAI的发现1995年，GuoS等试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因的表达。设计：反义RNA特异性地阻断par-1基因的表达；正义RNA以期观察到基因表达的增强。结果:

二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。

第23页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAI的提出直到1998年2月，FireA和MelloC才首次揭开这个悬疑之谜。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。他们证实，GuoS博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。

第24页，共54页，2023年，2月20日，星期四AndrewFire(1998.2华盛顿卡耐基研究院)mRNA制备中污染微量D.SRNA特异性地降解mRNAofpar-1injectionC.elegansInterruptionexpressionofpar-1证明；Dr.SuGuomRNAofPar-1纯化的S.SmRNAofpar-1c.elegans

极微弱抑制纯化的D.SmRNAofpar-1c.elegans特高效抑制NamedRNAinterference(RNA干涉)第25页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAI广泛存在于自然界RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

第26页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAi是转录后水平的基因沉默的机制注射D.SExonmRNA被干涉注射D.SIntronorpromoterseq.mRNA不被干涉d.SRNAi具有极高的干涉特异性仅降解与其相应的mRNA成为21-26小mRNA片断d.SRNAi具有极高的干涉效率

极少的D.SRNAi可达到较对照高达2个数量级表型可达到缺失突变体效应可能存在干扰效应分子的扩增机制d.SRNAi的效应可穿过细胞传递，可在世代间遗传存在维持RNAi的特异信号小分子干涉的特征RNA第27页，共54页，2023年，2月20日，星期四干涉的可能机制RNARNAvirus的侵染转座子的转录反向重复序列的转录两个RNA分子的互补单链RNA的分子内折叠

细胞中一组特异蛋白质(Dicer)D.SRNA结合依赖RNA的RNA聚合酶复制D.SRNARNAseIII降解D.SRNAatU21-25ntD.SRNA25ntsmallD.S.RNA(sD.SRNA)具有与对应mRNA足够的序列同源性第28页，共54页，2023年，2月20日，星期四干涉的可能机制RNA21-25ntsD.SRNA+蛋白质复合体结合

mRNAIf.D.SRNA的无义链与mRNA不互补ComplexwayoutfrommRNAIf.D.SRNA的无义链与mRNA发生互补交换置换sD.SRNA的有义链

RNAaseIII从sD.SRNA的无义链一端切断mRNA25nt25ntmRNA与sD.SRNA无义链、蛋白质结合，形成复合体，启动新一轮切割第29页，共54页，2023年，2月20日，星期四ThesiRNA(shortinterferingRNA)directscleavageofthemRNAinthemiddleofthepairedsegment.ThesereactionsoccurwithinaribonucleoproteincomplexcalledRISC(RNA-inducedsilencingcomplex)第30页，共54页，2023年，2月20日，星期四干涉的可能机制RNARNA干涉一旦启动，就可将对应的mRNA

全部降解，达到缺失突变的效应sD.SRNA也可降解pre-RNA,但机率较低。25ntsD.SRNA极易穿过细胞，进行远距离的转移，并可进入生殖细胞传递下一代

由于pre-RNA存在时间短，同时有加工蛋白的结合，阻止干涉复合体的结合。第31页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAi/geneco-supression/genequelling

具有相同的机制基因共抑制/基因压制；转入的外源基因同时抑制自身及内源基因表达的基因沉默的现象具有相似的遗传特征（细胞间、世代间传递）具有相似的表型特点（25nt的小RNA）具有相似的作用机制（相同的蛋白酶类）（转录后的基因抑制）第32页，共54页，2023年，2月20日，星期四RNAi研究的意义合成并注射特异sD.SRNA基因敲出功能基因组理论研究大规模的基因突变不同发育阶段注射发育生物学理论研究抗病毒的sD.SRNAi

单抗、多抗动、植物在表型上达到的遗传效应相同于第33页，共54页，2023年，2月20日，星期四

技术方便、简单：

转化，注射、喂饲，抑制基因表达的时间灵活用于功能基因组分析与gene敲除DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变，反义RNA等传统方法比较的优点

高效（数十倍，上百倍）

注射一种特定的dsRNAi分子，即可产生多基因家族中多个基因同时剔除的表型

含有内含子的双链发夹状RNA（intron-containingD.S.hairpinRNA，ihpRNA）具有更强的抑制效果第34页，共54页，2023年，2月20日，星期四Micro-RNA第35页，共54页，2023年，2月20日，星期四MicroRNAs（miRNA)

areveryshortRNAsthatmayregulategeneexpression.Animalandplantgenomescodeformanyshort(~22base)RNAmolecules,calledmicroRNAs.MicroRNAsregulategeneexpressionbybasepairingwithcomplementarysequencesintargetmRNAs.第36页，共54页，2023年，2月20日，星期四miRNA研究的开端-----

时序调控小RNA（smalltemporal,stRNAs)1993年：Lee等在线虫（Caenorhabditiselegan）中发现了第一个定时调控胚胎发育的基因lin-4.2002年：Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个开关基因let-7

miRNA的发现第37页，共54页，2023年，2月20日，星期四MIRNA概念miRNA:micro-RNA,(stRNA)

它广泛存在于真核生物中目前已发现了300多种在机体发育分化中具有重要调控功能前体形式含有发卡样结构,成熟形式是21－25nt,ssRNA,不具有开放阅读框（ORF)第38页，共54页，2023年，2月20日，星期四miRNA的生成过程：细胞核出核胞浆加工Droshapri-RNAPre-RNAExportin5第39页，共54页，2023年，2月20日，星期四MECHANISM第40页，共54页，2023年，2月20日，星期四第41页，共54页，2023年，2月20日，星期四miRNA效应：RISC

细胞效应翻译译制mRNA水解第42页，共54页，2023年，2月20日，星期四miRNA和siRNA的作用方式ImperfectmatchBlocktranslation存在植物、酵母哺乳细胞？Near-perfectmatchDegrademRNA第43页，共54页，2023年，2月20日，星期四MIRNA与SIRNA的联系：均为Dicer的产物：长度均为22nt左右

5＇端是磷酸基

3＇端是羟基均需Argonaute家族蛋白的存在同为RISC的组分二者进化关系上可能的两种推论：

siRNA是miRNA的补充

miRNA在进化过程中替代了siRNA沉默机制有重叠第44页，共54页，2023年，2月20日，星期四不同点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变相对较低，一个突变不影响miRNA的效应作用方式RNAi途径miRNA途径生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs(pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNA；发生在细胞核和细胞质中第45页，共54页，2023年，2月20日，星期四Argonaute蛋白质各有不同的AGO蛋白质各有不同的AGO蛋白质互补性一般要求完全互补不完全互补，存在错配现象RISCs的分子量不同siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物学功能不同ⅰ抵抗病毒的防御机制；ⅱ沉默那些过分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的破坏。对有机体的生长发育有重要作用重要特性高度特异性高度的保守性、时序性和组织特异性作用机制单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（offtarget）。成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。加工过程siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。对RNA的影响降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关作用位置siRNA