微生物来源的SOD提取分离纯化工艺

微生物来源的SOD提取分离纯化工艺第1页/共12页微生物来源的

SOD制备与活力测定2第2页/共12页SOD研究背景一种金属酶类与细胞的需氧代谢密切相关存在广泛 大量数据表明，所有需氧细胞包括最简单的微生物体内都含有SOD。迄今人们已分别从细菌、真菌,原生动物,藻类,昆虫,植物（如茶叶,大豆,小麦叶片和小白菜等）,动物（如肝脏、血液）等生物材料中分离得到SOD。3第3页/共12页依据SOD分子中所含的金属离子不同，可大致分为以下三类：Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD。此外，有研究表明，在牛肝中还发现一种Co/Zn-SOD。三类SOD的性质和存在SOD研究背景名称金属辅离子颜色分子量λmax(nm)存在Cu/Zn-SODCu,Zn蓝绿色32000258,680主要在真核细胞胞浆内Mn-SODMn粉红色40000280,457主要来自原核细胞80000真核生物线粒体Fe-SODFe黄色38000280,350只存在于原核细胞

4第4页/共12页不同生物材料SOD含量差别很大,既使同一生物,不同组织中的SOD含量差别也各不相同。

其中以动物肝脏组织中SOD含量最为丰富。

动物来源的SOD制备技术也最为成熟，主要是从动物肝脏和血液中提取。价廉而富含SOD的植物组织和微生物也是制备SOD的理想原料。

SOD研究背景5第5页/共12页SOD是需氧微生物在有氧环境中生存的必要条件，细菌SOD主要是Mn-SOD和Fe-SOD，也有少量细菌中含有Cu/Zn-SOD。本实验拟用伤寒沙门氏菌提取SOD微生物细胞中SOD的提取纯化工艺6第6页/共12页提取思路培养细菌微生物细胞中SOD的提取纯化工艺破壁离心收上清盐析溶解目的蛋白阴离子离子交换色谱洗脱7SOD等电点：4-5SOD存在于胞浆第7页/共12页微生物细胞中SOD的提取纯化工艺具体操作

伤寒沙门氏菌37℃，120r/min摇床培养24h4000r/min离心5min收集细菌55%硫酸铵盐析80%硫酸铵盐析洗3次，悬浮于其中菌体重悬液超声波法破碎细胞透析液3000r/min0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液分级沉淀蛋白沉淀20mmol/L磷酸盐缓冲液溶解透析至外液不含NH4+上清液8接种于LB培养基第8页/共12页微生物细胞中SOD的提取纯化工艺依次用不同浓度pH7.8的磷酸钾缓冲液洗脱20mmol/L100ml,30mmol/L100ml,30-100mmol/L200ml流速为0.5ml/min洗脱液旋转蒸发仪浓缩至1/3倍体积浓缩液过DEAE纤维素层析柱（DE-32）DE-32预先用10mmol/L磷酸钾缓冲液平衡10-100mmol/L磷酸钾缓冲液100ml活性产物-30℃保存9透析液过DEAE纤维素层析柱（DE-32）DE-32预先用20mmol/L磷酸钾缓冲液平衡洗脱第9页/共12页含量测定---分光光度法

Mn-SOD与Fe-SOD在λ280nm有最大吸收测样品A280，参考标准酪蛋白在A280处做出的标准曲线，确定浓度。SOD酶活测定---邻苯三酚自氧化法

SOD存在下，体系中邻苯三酚自氧化速率降低，自氧化中间产物积累减少。连续测定体系的A420。通过与不含SOD的空白组（自氧化速率控制在0.060A/min）做比较，计算出自氧化速率在0.030A/min时的酶量，即为一个酶活力单位。

SOD含量测定与活力测定10第10页/共12页讨论优点：本方法采用硫酸铵分级沉淀提取法，避免了因有机溶剂处理使SOD失活的缺点。而且可以同时分离得到Mn-SOD与Fe-SOD。不足：整个过程较为复杂，至少需要2-3次上柱层析总结：从微生物中提取SOD主要受以下三个方面影响：提取方