微生物学的资料

微生物学的资料第1页/共111页微生物遗传学涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒的遗传；介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的表达与调控、遗传变异的基本规律；介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有效地控制或利用微生物的基本策略。

第2页/共111页第一节遗传的物质基础及其特性 一、遗传物质的鉴定 二、脱氧核糖核酸 三、基因组DNA和染色体 四、染色体以外的遗传因子第3页/共111页经典试验1.肺炎链球菌的转化试验

图8.1（a）S型和R型细胞侵染试验一、遗传物质的鉴定第4页/共111页分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化

图8.1（b）第5页/共111页第6页/共111页第7页/共111页结论细胞生物的遗传物质是双链DNA病毒的遗传物质可以是单链的或双链的DNA或RNA，即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。第8页/共111页二、脱氧核糖核酸1．核酸的化学组成和结构

2．DNA的复制方式

3．DNA的理化性质第9页/共111页1．核酸的化学组成和结构

Watson和Crick在1953年描述了DNA的结构模型：

DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键相互交联的碱基处于双螺旋的内部。腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的序列。第10页/共111页RosalindFranklin

的贡献

WatsonandCrickproposedDNAstructurein1953bybuildingmodelsbasedonchemicalandphysicaldatathathadbeengatheredinotherlabs,primarilyx-raydiffractiondatacollectedbyRosalindFranklin

etal.第11页/共111页2．DNA的复制方式

细菌DNA的q-形复制真核生物DNA的复制10～100

mm

复制叉复制叉复制原点

模板 新生链第12页/共111页DNA的滚环复制模式

图8.2切口5’5’3’3’3’

模板 新生链新链连续复制互补链合成第13页/共111页3．DNA的理化性质DNA的稳定性在溶液中，DNA具有一定的粘性，易受剪切力的破坏；易被核酸酶降解；在强酸中，DNA能被水解成碱基、糖和磷酸；在特定的稀酸中(如pH3~4)，不同碱基与核糖之间的糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特异性可测定DNA的碱基序列；在稀碱如0.2当量NaOH中，双链DNA很快变性产生单链DNA，继而单链DNA被进一步破坏。第14页/共111页3．DNA的理化性质（2）DNA的光学性质

DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰的光波波长为260纳米；当浓度为1mg/ml时，

dsDNA：A260=20 ssDNA、RNA：A260≌25

人们根据A260测定DNA的浓度，根据A260/

A280和估算DNA的纯度。第15页/共111页3．DNA的理化性质（3）DNA的热变性双链DNA在一定的高温下解链(变性)产生单链DNA。双链DNA完全解链后，紫外吸收值A260可以提高40％，当吸收值的提高达到中点时的温度称为解链温度（Tm）。1.41.21.0708090100°CTm第16页/共111页3．DNA的理化性质（4）复性、退火或杂交

当温度缓慢降低时，序列互补的单链DNA能够渐渐地重新配对，即复性。不同来源的DNA之间碱基序列互补的区段进行的碱基配对称为退火或杂交，这被广泛应用于DNA的扩增、定点诱变、基因鉴别。第17页/共111页3．DNA的理化性质（5）分子特征与微生物分类鉴定

DNA中的G＋C含量通常通过Tm值来测定。同一个属的细菌，G＋C含量的变化一般小于10％。

DNA－DNA杂交技术用于研究亲缘关系近的微生物。如果两菌株在最适条件下杂交，DNA相关性>70%，且Tm值差别<5％，它们就被认为同种。第18页/共111页三、基因组DNA和染色体

基因组是指一种生物体内单套遗传物质的全部遗传基因。染色体指携带细胞功能所必备的基因的遗传单元。

病毒是非细胞生物，它们的全套遗传基因称为基因组，但不足以形成染色体。

原核生物的染色体常为一个环状的DNA分子。

真核生物的细胞有几条至几十条染色体，各含一个线状的DNA分子。

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细菌染色体DNA的大小和结构(a)大肠杆菌细胞大小和染色体DNA长度的比较；(b)细菌细胞中的拟核；(c)大肠杆菌染色体结构电镜图。宽1.1~1.5mm、长2~6mm的细胞里包装着的一个DNA分子的长度达1mm；这个环状的DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染色体的中心有一个由DNA结合蛋白和膜组成的骨架，DNA分子附着在骨架上形成50~100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约50~100kb，这种多层次折叠使DNA处于高度压缩状态.Fromfiguresinreferencedbook5.第20页/共111页真核生物细胞中的DNA中只有不到5％的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈6个核小体、直径30nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。真核生物的染色体结构

FromBIOLOGYbyJackCCareyetal.,eds第21页/共111页四、染色体以外的遗传因子

线粒体和叶绿体中含有的DNA能够自体复制，并编码执行线粒体和叶绿体功能的蛋白，属于染色体以外的遗传因子。

质粒一般指存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体以外，能进行自我复制的遗传因子。质粒的大小为1～1000kb，常为环状的双链DNA分子，也有线状DNA或RNA质粒。有些质粒既能够整合到染色体上，又能以游离状态存在，并能携带部分染色体基因进行转移，它们被称为附加体。

第22页/共111页第二节遗传信息的表达

一、真核生物基因的转录及其调控 二、原核生物基因的转录及其调控 三、翻译过程中的调控 四、调控信号与系统性调控第23页/共111页主要调控机制的调控模型

图8.5第24页/共111页一、真核生物的基因转录及其调控

1.真核生物的基因转录 常见启动子是位于转录起始位点上游25－30个碱基对的TATA盒；另一些基因则含有一个与转录起始位点重叠的起始元件。

RNA聚合酶Ⅱ催化合成的是Pre-RNA，它必须经过加工才形成成熟mRNA。

Pre-RNA的加工在细胞核中进行，主要加工步骤：5´端加帽、3´端加尾、剪接去除插入子等。

第25页/共111页

发生在pre-mRNA转录的早期，当新生RNA分子长度达到25～30核苷酸时，加帽酶使新生转录物的5´端第一个核苷酸(A或G)g位的磷酸水解，并加上7-甲基鸟苷三磷酸。2.5´端加帽反应和帽子结构

图8.8帽子结构：5´端第一个核苷酸是7-甲基鸟苷三磷酸，它以5´三磷酸酯键与第二个核苷酸的5´端相连，而不是通常的3´,5´磷酸二酯键。甲基第26页/共111页3.

3´端的加尾过程

3´端加poly(A)发生于插入子剪切之前。

Pre-mRNA的尾部具有非编码区，其3´端约20个核苷酸之前有一个称为多聚A位点的序列AAUAAA。特异性的核酸内切酶识别多聚(A)位点后，切除其后面的20个核苷酸并产生3´端游离羟基。在poly(A)聚合酶的作用下，20～250个腺嘌呤核苷酸被加到3´端，产生poly(A)。第27页/共111页 pre-mRNA中有编码和不编码蛋白质的序列相间排列，其中不编码蛋白质的序列被称为插入子；编码蛋白质的序列被称为表达子。4.

剪接去除插入子第28页/共111页插入子的切除和表达子的拼接自参考书2第29页/共111页5.真核生物基因转录的调控

真核生物基因表达的调控作用可能发生在转录、mRNA修饰和稳定、翻译、mRNA的转运和降解等各个步骤。 真核细胞中基因表达的调控信号包括两类：一类是激素和蛋白质分子，另一类是外环境因素。第30页/共111页二、原核生物基因的转录及其调控

1.细菌的基因转录过程

mRNA不需要加工，转录与翻译同步。

启动子：在－10和－35区具有特征性的序列，被不同的σ因子所识别。

多顺反子：功能相关的多个基因往往聚集成一个操纵子，处于同一个转录单元中。第31页/共111页

细菌的转录和翻译同步进行

图片来自参考书2第32页/共111页2.σ因子参与的转录调控 细菌RNA聚合酶的核心酶的功能对任何基因都一样，而σ因子才是选择转录对象的关键亚基。 每一种σ因子识别的启动子在－10和－35区都具有特征性的序列。

－10和－35区不仅被不同的σ因子所识别，而且是决定启动子强度。第33页/共111页例：大肠杆菌 在正常生长条件下，分子量为70kDa的σ70指导RNA聚合酶的活动； 当细胞需要进行趋化移动时，就产生分子量为28kDa的σ28启动鞭毛和趋化蛋白的合成； 如果环境温度突然上升，细胞会产生分子量32kDa的σ32启动热休克蛋白基因的转录以保护细胞不受高温伤害，并清除已变性的蛋白。

第34页/共111页3.操纵子和转录的正、负调节

在原核细胞中，几个功能相近或相关的结构基因经常有序地排列在一起，并被转录在同一个RNA分子上；这种由一个转录控制区和1至多个结构基因组成的一个完整的转录单元称为操纵子。 有些基因需要在活化蛋白结合到DNA的特定位点后才能有效表达；由活化蛋白激活或促进基因转录的调控方法叫做转录的正调节。 由阻遏蛋白结合到DNA的特定位点上，对转录的起始发生阻遏或解阻遏作用，这种调控方法被称为转录的负调节。

第35页/共111页例：乳糖操纵子的结构

图8.6

其中有两个调控基因：（1）阻遏蛋白的结合位点Oprator，乳糖参与负调节；（2）激活蛋白CAP的结合位点，cAMP参与正调节。

参考书1第36页/共111页衰减作用是通过衰减子使已经开始的转录提早终止，从数量上减少完整mRNA的产生。图8.74.衰减作用第37页/共111页三、翻译过程中的调控固定式的调控：包含在DNA序列之内，如稀有密 码子和重叠基因等，其调控不受环境影响。非固定式的调控：作用受环境因素的影响，与

DNA 序列无关。 稀有密码子出现频率 基因的重叠排列

SD序列、与起始密码子的间距

mRNA形成的二级结构 反义RNA的存在

影响翻译速度的因素第38页/共111页四、调控信号与系统性调控微生物必须对生存条件的变化迅速作出反应；必须与其它个体或群体进行竞争，获取并有效地利用营养物质。必须能够产生、感应、传递信号，同时对多个相关的操纵子进行系统性调控。第39页/共111页1.葡萄糖效应及其机理

当培养基中同时有葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖存在时，大肠杆菌首先利用葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完毕，其它糖的代谢才能开始，这种由葡萄糖的代谢抑制其它糖代谢现象称为代谢抑制（cataboliterepression）或葡萄糖效应。

第40页/共111页代谢抑制机理

细胞大量摄入并代谢葡萄糖，cAMP的含量随之降低，使受cAMP正调控的乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、麦芽糖操纵子等都不能被激活。 缺乏葡萄糖，或者人为地向培养基中加入cAMP，细胞中cAMP的浓度升高，产生的cAMP-CAP复合体与DNA结合，激活代谢乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖的操纵子。第41页/共111页2.严紧反应

细菌在生长过程中如果得不到足够的氨基酸，细胞内鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)的含量迅速上升；与此同时，RNA的合成速率迅速降低，蛋白质的合成也随之下降，从而细胞处于低速代谢和缓慢生长状态。当环境中出现足够的氨基酸时，pppGpp和ppGpp被迅速降解，RNA和蛋白质的合成很快恢复。这是在困难时期获得生存的策略，被称为严紧反应（stringentcontrol）。

第42页/共111页3.菌量感应系统

有些细菌具有一种能够感应自身细胞群体密度并对其作出相应的应答反应的调控系统。 这些细菌在生长过程中释放某种信号分子，当细胞群体密度达到了一个临界水平时，信号分子积累到起诱导作用的浓度，从而激活目标操纵子，这种调控叫做菌量感应作用(quorumsensing)。

第43页/共111页4.双组分磷酸接力系统

双组分磷酸接力系统又名双组分信号传导系统，是一种通过磷酰基团的转移来传导信号，并控制基因转录的调节系统。 双组分是：传感蛋白激酶、应答调节蛋白。 双组分系统广泛存在于细菌中，也存在于真核微生物中；高等真核生物也利用磷酸化这一信号传导机制传递信号。

第44页/共111页

例：枯草杆菌调控芽孢形成的双组分磷酸接力系统

在营养生长阶段，枯草杆菌RNA聚合酶利用σA

对与其营养生长有关的基因进行转录；KinA、B、C、D等对环境信号进行传感反应的蛋白激酶，在营养细胞中以非磷酸化的形式存在。当这些激酶感应到不适于生长的信号时发生磷酸化；磷酸化的KinA等将磷酸基团转移到SpoOF；SpoOF将磷酸基团传递给SpoOB；SpoOB再将磷酸基团传递给SpoOA。磷酸化的SpoOA能与abrB基因的启动子结合并阻遏abrB基因的表达，AbrB是许多基因表达的抑制蛋白；图8.8

磷酸化的SpoOA能够激活σF、σE

等Sigma因子的合成。 当细胞内的部分σA被σF、σE

取代时，芽孢开始形成，负责芽孢形成后期基因的转录的σG和σK逐渐产生。第45页/共111页第三节细胞中遗传信息的变异 一、微生物的遗传变异现象 二、基因突变的分子基础 三、基因重组 四、原核生物细胞间的基因转移 五、真核微生物细胞间的基因交换第46页/共111页一、微生物的遗传变异现象

自发突变发生的频率很低，观察自发性突变的经典试验是波动试验。自发突变和诱发突变的本质相同：由于理化因子作用于DNA，导致遗传性状的变化。少数几个细胞的遗传变异能够使微生物群体完全地改变成新的菌落。

遗传学中常用的突变株包括营养缺陷型、抗药突变型、温度敏感型等。第47页/共111页

抗T1噬菌体的大肠杆菌的波动试验

表8.1第48页/共111页艾姆氏试验的基本方法缺陷型菌株营养缺乏型平板37℃2～3天.. ......:.¨.:..:..;.;...¨.:.:.¨.:..:..;.;...¨.:.. .....待测试剂(图8.10)

正常回复突变诱变剂诱变艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法，其原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。

第49页/共111页二、基因突变的分子基础 DNA分子与其它物质发生反应形成非正常结构的现象称为DNA损伤。

DNA损伤的结果是导致基因突变或者细胞死亡。

DNA分子自身的活动能够导致碱基错配；此外，DNA损伤的分子机制都是由已知的或未知的理化因素对DNA的结构产生了破坏作用。第50页/共111页

已知的化学致变剂和物理致变剂

物理致变剂

致变剂

电离辐射、紫外辐射等

化学致变剂脱氨剂、烷化剂、

大型加合物供体、碱基类似物、 插入剂、交联剂。第51页/共111页常见的致变剂及其致变作用

图7.11

亚硝基的脱氨作用；(b)烷化剂和被甲基化的碱基；(c)5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对。第52页/共111页

嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物

图7.12第53页/共111页分子的变异与信息的变化第54页/共111页三、基因重组

同源重组是生物中普遍存在的一种基因重组方式，其特点是可以在任何位置、任何两个具有同源序列的DNA分子之间发生，需要类似RecA的蛋白参与。 位点特异性重组依赖于小范围同源序列的联会，特点是需要在供体和靶分子中包含特定的DNA序列，并且需要特异性的蛋白质因子识别和催化。 转座子是可在一个DNA分子内或不同DNA分子间移动的DNA片段。转座作用即由转座子介导的DNA重排现象，它不需DNA同源性，无RecA参与；转座子的末端带有倒置重复序列，由转座酶识别和切割。第55页/共111页

大肠杆菌l噬菌体在特异性位点插入染色体(a)和脱离染色体的方式(b)

位点特异性重组

图8.14第56页/共111页

转座子的插入和靶序列正向重复的产生过程。转座作用

图8.15第57页/共111页四、原核生物细胞间的基因转移

在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程叫做接合作用(conjugation)。

转化(transformation)是指细胞从周围介质中摄取来自不同基因型细胞的DNA，使受体的基因型或表型发生相应变化的过程。

转导(transduction)是由噬菌体介导的将DNA片段从供体菌转移到受体菌的过程。

第58页/共111页大肠杆菌中的F质粒及其接合作用

图8.16

第59页/共111页

大肠杆菌l噬菌体介导的转导

图8.17

(a)普遍性转导 (b)特异性转导

第60页/共111页五、真核微生物细胞间的基因交换准性生殖与有性生殖的比较表8.2第61页/共111页第四节微生物的诱变育种 和遗传工程

一、菌株的诱变和筛选 二、DNA重组技术的发展 三、基因工程 四、生物种系的遗传改良第62页/共111页一、菌株的诱变和筛选

物理致变剂

致变剂

e.g.X-rays,g-rays,UV

化学致变剂

e.g.baseanalogs,nitrousacid, alkylating,arylatingagents第63页/共111页UVLVLPhotolyase例：紫外线诱变的分子基础第64页/共111页

紫外线诱变的操作步骤第65页/共111页青霉素生产菌的诱变育种菌株NRRL-B25的诱变过程Strain Mutagen Yield(U/ml)TimeNRRL-B25 250 1943NRRL-X1612 X-rays 500 1943NRRL-Q176 UVlight 850 1945NRRL-WIS-47-1564UVlight 850 1947--- --- 50000 1977第66页/共111页对早期生物技术的发展贡献巨大；适用于途径或基因未得到研究的菌株；产生的变异程度相对较低；变异的位点及性质不明；没有相应的基因就不可能发生新功能。诱变育种技术的特点第67页/共111页二、DNA重组技术的发展

1.限制性核酸内切酶

2.逆转录酶

3.DNA连接酶

4.DNA聚合酶和聚合酶链式反应第68页/共111页

1.限制性核酸内切酶

20世纪60年代末Arber等发现细菌能够产生识别特定的DNA序列并对其加以切割的酶，即限制性核酸内切酶，简称DNA内切酶。这个发现标记着DNA重组技术的诞生。 工具酶识别序列是4～8个核苷酸，这些位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回纹结构.图7.18.(a)第69页/共111页

限制性核酸内切酶的切割方式

粘性末端：两条单链上的断裂位置交错且对称，所产生的两个末端含有单链的互补序列。

平端切割：两条单链上的断裂位置处在一个对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等。XhoISciI图7.8.限制性内切酶切割方式实例（b）、（c）第70页/共111页

2.逆转录酶

逆转录酶是以RNA为模板合成序列与其互补的DNA链。1970年，科学家发现逆转录病毒以逆转录酶合成它们RNA基因组的DNA拷贝。 以5´→3´方向合成DNA，前提条件：有一段引物、一条模板分子、四种脱氧核糖核苷酸、镁离子。

第71页/共111页

3.DNA连接酶

DNA连接酶是一种能够催化DNA中相邻的3´-OH和5´-磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的一种酶。

1972年，DavidJackson等使DNA片断的粘性末端退火（即碱基彼此配对），然后用DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与外源DNA的连接技术，成功地获得了重组DNA分子。第72页/共111页4.DNA聚合酶和聚合酶链式反应

DNA聚合酶在有一条DNA单链为模板和一段寡核苷酸为引物的条件下，催化与模板互补的另一条DNA新链的合成反应。1985年KaryMullis等用DNA聚合酶创建了聚合酶链式反应(PCR)；用该技术进行特定DNA片段的体外扩增，可以在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝。 由于PCR技术对现代生物技术发展的巨大贡献，发明人获得了诺贝尔奖。第73页/共111页来自极端微生物的热稳定性DNApolymerase如来自Thermusaquatcus

的Taqpolymerase 95ﾟC，半衰期>2h

使PCR实现自动化。上图为PCR仪，下图为示PCR循环。T(ﾟC)

907050Time(min)循环1 循环2循环3循环第74页/共111页三、基因工程

1.基因工程总体策略

2.目标基因的克隆与鉴定

3.宿主和载体

4.重组蛋白的生产第75页/共111页1.基因工程总体策略（1）

基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。第76页/共111页基因工程总体策略（2）重组蛋白的生产 品种、菌株改良 遗传基因分析第77页/共111页2.目标基因的克隆与鉴定第78页/共111页蓝-白选择第79页/共111页活性筛选第80页/共111页放射自显影或生色反应用32P标记探针迪高莘标记探针及Marker第81页/共111页3.宿主和载体

克隆载体

是一个能复制的DNA分子，被用来运载插入的外源基因进入受体细胞。它可以是质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体。

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed.第82页/共111页外源基因由克隆载体携带进入宿主细胞OriAmpRForeign

geneMCSVectorscarrygenesintohostcells第83页/共111页质粒图谱范例第84页/共111页大肠杆菌K12及其衍生菌株第85页/共111页重组蛋白生产的优势: a.

可以对基因加以改造; b.

基因拷贝数大量提高; c.

用强启动子进行快速转录; d.基因翻译得到优化; e.可进行主动调节; f.

宿主细胞易于培养.4.重组蛋白的生产第86页/共111页a.基因定位突变技术GGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTCCCAAAGGGCCCAAATTTGGGTTTCCCGGGTTTAAAGGGTTTAAATTTYYYXXXGGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTYYYYYYXXXXXXYYYAAATTT

CCCAAAYYYXXXTTTAAA

GGGTTTXXXBluntingKination LigationPCR第87页/共111页极耐热性木聚糖酶基因的突变效果第88页/共111页DNAmRNAProtein基因组 重组基因转录翻译多拷贝强转录优化翻译b.c.d.

蛋白质合成过程中的优势第89页/共111页E.coli中lac启动子

lac&trp启动子的杂 合体Ptac

E.coli

噬菌体T7启动 子

E.coli

的l噬菌体启 动子PLphage

PHshfrom E.colie.主动调节E.coli表达体系中的调控模式第90页/共111页

PL启动子的表达调控PL+1RBS FG Terminator

30℃40℃mRNA热激热敏感性抑制子cI第91页/共111页

T7启动子的表达调控T7Promoter待表达基因宿主细胞宿主染色体质粒质粒PlacT7RNA聚合酶基因第92页/共111页f.极端酶高效表达极耐热性木聚糖酶基因的表达第93页/共111页四、生物种系的遗传改良 及疾病的基因治疗和基因药物

1.基因重组微生物

2.通过植物转基因改良品种

3.动物的转基因

4.基因治疗与基因药物第94页/共111页定义：代谢(途径)工程istheuseofmoleculartechniques(orrecombinantDNAtechniques)toimprovetheefficiencyofpathwaysthatsynthesizespecificproducts.

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed1.基因重组微生物第95页/共111页Zymomonasmobilis的乙醇发酵途径Entner-Doudoroffpathway丙酮酸乙醛+CO2乙醇乙醇脱氢酶丙酮酸脱羧酶第96页/共111页E.coli

的部分代谢途径

EMP途径乳酸 丙酮酸 甲酸 CO2+H2

乙酰辅酶A

磷酸转移酶 乙醛脱氢酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脱氢酶 乙酸 乙醇 乳酸脱氢酶

第97页/共111页E.coli

的代谢工程

EMP途径乳酸 丙酮酸 乙醛 甲酸 CO2+H2

乙酰辅酶A 乙醇

磷酸转移酶 乙醛脱氢酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脱氢酶 乙酸 乙醇 乳酸脱氢酶

丙酮酸脱羧酶乙醇操纵子设计宿主菌株的选择基因的整合表达水平的筛选条件优化等乙醇脱氢酶外原基因构建途径第98页/共111页利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株菌株 产量得率 速率 （g/l）（%）（g/l/h）Sacharomyces140021.0981.60Z.mobilisCP4 22.6881.04E.coliKO1134.7801.16代谢工程菌发酵水平比较第99页/共111页2.通过植物转基因改良品种

农杆菌属细菌生活在土壤中，从伤口侵入植物组织后，将T-DNA插入植物的染色体，产生激素刺激细胞生长，并指导细胞合成细菌所需要的营养物质。

A.tumefaciens促使细胞过量生长产生大块细胞团，引起冠瘿病；A.rhizogenes侵染植物根部导致异常生长，形成“发根”。 这两个种是植物遗传工程的重要工具。第100页/共111页T-DNA整合分泌细胞分裂素植物生长素植物细胞核孔VirD2分泌冠瘿碱伤害分泌乙酰丁香酮农杆菌细胞核Pi-VirA诱导vir表达从Ti质粒中切出T－DNAVirD4VirD2VirB农杆菌和植物的相互作用第101页/共111页

用Ti质粒构建的穿梭载体第102页/共111页

3.动物的转基因最有效方法：用病毒转染动物或动物胚胎。主要目的：用动物表达产生人类特定的组织或器官；建立人类疾病治疗的动物模型；昆虫、猪、羊等都能被用来表达人类蛋白。

第103页/共111页逆转录蛋白（retrovirus）单链RNA，侵染哺乳动物；侵染后，RNA逆转录产生双链DNA；启动