微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色资料

微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色资料第1页/共9页一、实验目的1、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原理及步骤。2、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。3、巩固显微镜油镜的使用技术。实验二细菌的简单染色法和革兰氏染色法第2页/共9页二、实验原理1、细菌的简单染色原理①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料的染色部分带负电荷），因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。2、细菌革兰氏染色的原理G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保留初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫色。G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出，而使菌体变成无色，再经番红复染就成为红色。第3页/共9页三、实验器材1、菌种：革兰氏染色：培养12h～16h的枯草芽孢杆菌120和培养24h的大肠杆菌。2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄或蕃红3、器材：载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。菌龄对革兰氏染色结果的影响：选取处于活跃生长期——指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌体尚未成熟或菌体过老，可能使染色结果呈现相反的结果。第4页/共9页（一）简单染色的步骤（见P11）1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；

在载玻片中央滴一小滴生理盐水，

用接种环以无菌操作取少许菌体于水滴中（注：不要挑破培养基），

混匀并涂成薄膜（注：涂片不易过厚）。2、干燥：用夹子夹住载玻片一端（菌膜面朝上），反复通过火焰高处数次，

烘干菌液（注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形）。3、固定：用夹子夹住载玻片一端，迅速通过火焰2～3次，

使菌体固定于载玻片上。4、染色：将玻片平放于玻片架上，加适量（以盖满菌膜为度）染液于涂片上。

染色时间1-2min。5、水洗：倒去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗（切勿将菌膜冲掉），

直至流下的水为无色为止。6、干燥：将玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。7、镜检：先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察。四、实验步骤第5页/共9页第6页/共9页（二）革兰氏染色（见P12)1、涂片、固定（1）涂片——“三区”涂片法。在载玻片的左端先加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合；将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在载玻片的右端加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合；将玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。（三区：左区——苏云金芽孢杆菌区；中央区——两种菌的混合区；右区——大肠杆菌区）。（2）干燥及固定。步骤同简单染色法。涂片不易过厚，否则造成局部菌体脱色不完全，而使G-菌呈现革兰氏阳性结果。2、染色（1）初染。将玻片置于玻片架上，加适量（以覆盖菌膜为度）结晶紫染液染色1～2min；倾去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水为无色。（2）媒染。加卢戈氏碘液一滴，染色1min，水洗。（3）脱色。将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。（4）复染。滴加蕃红复染2min后，立即水洗至流出液无色。（5）干燥及镜检。将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，G-菌转呈革兰氏阳性结果；如果脱色时间过长，G+菌转呈革兰氏阴性结果。媒染时间对革兰氏染色结果的影响：媒染时间过短，不利于结晶紫与细胞之间的结合，而使G+菌转呈革兰氏阴性结果;媒染时间过长，而使G-菌转呈革兰氏阳性结果。第7页/共