微生物分离纯化接种与培养技术

微生物分离纯化接种与培养技术第1页/共17页细菌的分离纯化一、目的要求：1、学习微生物纯系分离、培养方法。2、掌握划线分离纯化微生物的方法。二、基本原理：为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。第2页/共17页第一节微生物纯培养二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-6第3页/共17页固体培养基分离纯培养１、稀释倒平板法：稀释－－不同稀释液少许与50oC左右的琼脂培养基混合—倾入平皿。2、涂布平板法：稀释－－倾入平皿－－不同稀释液少许涂布在琼脂培养基。3、平板划线分离法：少许待分离物—平板划线（连续划线和分区划线）。4、稀释摇管法：待分离物用培养基稀释—摇匀—在琼脂表面封石蜡。液体培养基分离纯培养同一稀释度做多个平行管，95%表现为不生长。第4页/共17页二、微生物纯培养技术4)操作要点：

无菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：

a、菌落特征；b、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：菌落特征一致性第5页/共17页固体培养基分离纯培养菌落:单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时。平板（培养平板）：它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。第6页/共17页3、平皿划线法用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第7页/共17页2、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。第8页/共17页单细胞（单孢子）分离在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单细胞（单孢子）培养。选择培养分离1、利用选择培养基进行直接分离。2、富集培养（多次培养后再分离）二元培养物：培养物中含有二种微生物。寄生物如病毒，原生动物如纤毛虫。第9页/共17页

为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。tupian第10页/共17页

土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.第11页/共17页三、材料与仪器1、培养基：阿斯毕无氮培养基。2、菜园土。3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等第12页/共17页四、方法与步骤（一）富集培养：:(上次已做实验)1、加入1ML土壤菌悬液于灭菌平板2、加入已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基，混匀。3、正面放置培养箱中培养，28oC培养3~4天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。第13页/共17页（二）划线分离纯化1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。划线方法如图：1234第14页/共17页（三）纯化、镜检，得到纯种培养1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，28oC培养3~4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。第15页/共17页五、注意事项：（1）在微生物分离、纯化每一操作环节，要严