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文档简介
真核细胞内膜系统、蛋白质分选与转运真核细胞在进化上一个显著特点就是出现了细胞内的区隔(intracellularcompartment),细胞质被分隔成不同的由膜包裹的区室,即被膜细胞器(MembraneBoundOrganelles
)。原核细胞和真核细胞的区别染色体主要类群细胞器细胞核细胞大小真核细胞原核细胞细菌、蓝藻、衣原体、放线菌有核膜,有成形的细胞核没有核膜,称为拟核较小(1μm~10μm)较大(10μm~100μ)有核糖体、线粒体、内质网、高尔基体、叶绿体(植物)等只有核糖体有染色体,染色体由DNA和蛋白质结合无染色体,环状DNA不与蛋白质结合动物、植物、真菌等真核贴壁内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡等虽然具有各自独立的结构和功能,但它们之间又紧密相关,每个细胞器都作为相互协调的功能单位的一部分而发挥作用。因而被总称为细胞内膜系统(endomembranesystem)。Anoverviewofthebiosynthetic/secretoryandendocyticpathwaysthatuniteendomembranesintoadynamic,interconnectednetwork.
EndosymbiosisEvolutionofNuclearMembraneandER从系统发生来看内膜系统起源于质膜的内陷和内共生从个体发生来看新细胞的内膜系统来源于原有内膜系统的分裂,具有核外遗传的特性。真核细胞的细胞质中,除去可分辨的细胞器以外的胶状物质,称细胞质基质(cytoplasmicmatrixorcytomatrix)。本章内容第一节细胞质基质的涵义与功能第二节细胞内膜系统及其功能第三节细胞内蛋白质的分选与膜泡运输第一节细胞质基质也被称为:细胞液(cellsap),透明质(hyaloplasm),胞质溶胶(cytosol)成分:主要含有与中间代谢有关的数千种酶类,与维持细胞形态和细胞内物质运输有关的细胞质骨架。水和无机离子(K、Na、Mg、Ca、Cl)脂、糖、氨基酸、核苷酸及其衍生物蛋白质、脂蛋白、多糖、RNA糖原等一些处于贮存状态的重要化合物细胞质基质的功能
完成各种中间代谢过程如糖酵解过程、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等与细胞质骨架相关的功能维持细胞形态、细胞运动、胞内物质运输及能量传递等蛋白质的修饰、蛋白质选择性的降解蛋白质的修饰控制蛋白质的寿命降解变性和错误折叠的蛋白质帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠,形成正确的分子构象
第二节细胞内膜系统及其功能内质网高尔基体溶酶体一、内质网K.R.Porter等于1945年发现于培养的小鼠成纤维细胞,因最初看到的是位于细胞质内部的网状结构,故名内质网(endoplasmicreticulum,ER)。真核细胞的内膜系统内膜系统成员内质网(endoplasmicreticulum,ER)内质网的形态结构内质网的基本类型内质网的化学组成内质网的主要功能返回上一层内质网广泛分布于除成熟红细胞以外的所有真核细胞中由单层单位膜构成的小管、小泡和扁平囊内质网膜围成相互连通的腔——内质网腔内质网膜与核膜外膜相连续内质网的分布状态和数量多少与细胞的生理功能相关,执行分泌功能的细胞内质网发达内质网(endoplasmicreticulum,ER)内质网的形态结构内质网的基本类型内质网的组成内质网的功能真核细胞的内膜系统内膜系统成员内质网的基本类型内质网包括粗面内质网(rER)和光面内质网(sER)两种类型;rER的形态主要为扁平囊状,膜上结合核糖体,腔内有特殊可溶性蛋白;sER的形态主要为小管、小泡,膜表面没有核糖体结合;内质网与蛋白质和脂类的合成有关。rERsER微粒体(microbody)
细胞匀浆后,粗面内质网扁囊形成小的封闭囊泡称为微粒体(A),光面内质网碎裂的小泡缺乏核糖体,称为光面微粒体(B)。密度梯度离心法制备微粒体2、结构和组成形态结构ER由封闭的膜系统及其形成的腔构成的相互沟通的网状结构。它从核膜延伸至细胞质中,靠近细胞质内侧。ER的膜占细胞膜系统的一半所包围的体积占细胞总体积的10%超薄和扫描电镜观察的内质网上部介透射电镜照片,下部是扫描电镜照片粗面内质网呈扁平囊状,排列整齐光面内质网呈分支管状或小泡状特征:大大增加了细胞内膜的表面积,为多种酶体系提供了大面积的结合位点。完整的封闭体系将其上合成的物质与细胞基质中合成的物质分隔开,利于它们的加工和运输,组成:内质网是膜囊结构,所以构成内质网的主要化学成份是蛋白质和脂。葡萄糖-6-磷酸酶,普遍存在于内质网,被认为是标志酶2、结构和组成内质网(endoplasmicreticulum,ER)内质网的形态结构内质网的基本类型内质网的组成内质网的功能微粒体(microsome):内质网的一种特化类型在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构。在体外实验中,具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。真核细胞的内膜系统内膜系统成员内质网的主要功能蛋白质合成;脂类的合成;蛋白质的修饰与加工;新生多肽链的折叠与装配;内质网的其他功能:肌浆网。内质网的功能光面内质网的功能:脂类合成类固醇激素的合成脱毒作用糖原分解释放葡萄糖调节钙功能粗面内质网的功能:蛋白质合成蛋白质的修饰和加工新生肽链的折叠和装配脂质的合成几乎全部的膜脂都由内质网来合成,如磷脂(磷脂酰胆碱)、胆固醇将胆固醇氧化、还原、水解,转变成各种类固醇激素。合成:磷脂合成酶是ER膜整合蛋白,活性位点朝向cytosol,因而磷脂的合成都是在内质网的胞质溶胶面进行(seenext)。在光面内质网上合成的磷脂先作为内质网膜的构成部分,然后再转运给其他的膜。光面内质网的功能Thesynthesisofphosphatidylcholine.Thisphospholipidissynthesizedfromfattyacyl-coenzymeA(fattyacylCoA),glycerol3-phosphate,andcytidine-bisphosphocholine(CDP-choline)脂质的合成转位:在内质网上合成的磷脂几分钟之后就由胞质溶胶面转向膜的另一面,即内质网腔面,磷脂的转位是由内质网膜中磷脂转位蛋白(phospholipidtranslocator)或称翻转酶(flippase)帮助的。转运:
内质网中的磷脂向其它膜的转运有两种方式:出芽(budding):ER→GC、Ly、PM磷脂转换蛋白(phospholipidexchangeproteins,PEP):磷脂分子+PEP→细胞质基质→靶膜(线粒体、过氧化物酶体的膜)(seenext)光面内质网的功能糖原分解与游离葡萄糖释放在肝细胞中,糖原裂解释放葡萄糖-1-磷酸,然后再转变成葡萄糖-6-磷酸,由于磷酸化的葡萄糖不能通过细胞质膜,光面内质网上的葡萄糖-6-磷酸酶将葡萄糖-6-磷酸水解为葡萄糖和磷酸后,葡萄糖就可穿过细胞质膜进入血液光面内质网的功能解毒作用(detoxification)肝细胞中的光面内质网很丰富,其中含有一些酶,用以清除脂溶性废物和代谢产生的有害物质。如细胞色素P-450家族酶系能使聚集在光面内质网上的不溶于水的废物或代谢产物羟基化而完全溶于水转运出细胞进入尿液中。光面内质网的功能贮Ca2+功能:肌质网(sarcoplasmicreticullum)是肌细胞内特化的光面内质网,是贮存Ca2+的细胞器。光面内质网的功能粗面内质网的功能蛋白质合成场所TranslocationofsolubleproteinsacrossER粗面内质网的功能蛋白质的合成向细胞外分泌的蛋白质膜的整合蛋白质细胞器中可溶性驻留蛋白质(solubleproteinsthatresidewithincompartmentsoftheendomembranesystem)蛋白合成途径蛋白的分选
分泌蛋白的信号假说
细胞中蛋白质的合成都起始于细胞质基质中“游离”的核糖体,一些蛋白起始合成不久便转移到内质网上继续合成,另一些则停留在胞质核糖体上合成。
决定转移的因素是什么?
1975年,G.Blobel依据实验提出了分泌蛋白的信号假说理论:分泌蛋白的N端序列是信号序列(肽),指导分泌蛋白到内质网上合成,在蛋白合成结束之前信号肽被切除。信号假说的提出Blobel及其同事在上世纪60年代末,利用免疫球蛋白重链mRNA进行(离体)无细胞体系合成实验,发现:(1)如果在离体体系加入微粒体,新生多肽可进入微粒体内;(2)进入微粒体的多肽较无微粒体体系合成的多肽在氨基端截断了一段。他们认为这段多肽起到了某种信号作用,由此提出了信号假说。信号假说的提出Blobel及其同事在上世纪60年代末,利用免疫球蛋白重链mRNA进行(离体)无细胞体系合成实验,发现:(1)如果在离体体系加入微粒体,新生多肽可进入微粒体内;(2)进入微粒体的多肽较无微粒体体系合成的多肽在氨基端截断了一段。他们认为这段多肽起到了某种信号作用,由此提出了信号假说。核糖体展示技术基因控制生物性状指导合成蛋白质体现者基因指导蛋白质合成的过程,叫基因的表达。问题:基因是怎样指导蛋白质的合成呢?AG
T
AC
AAAT
UCAUGUUUAmRNA细胞质
细胞核
核孔DNAmRNA在细胞核中合成UCAUGUUUAmRNAAUGGAUAUCmRNA?甲硫氨酸CUA反密码子核糖体UCAUGAUUAAAU
亮氨酸ACU
天门冬酰氨AUG
异亮氨酸
tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置UCAUGAUUAAAU
亮氨酸ACU
天门冬酰氨AUG
异亮氨酸
两个氨基酸分子缩合缩合UCAUGAUUAAAU
亮氨酸ACU
天门冬酰氨AUG
异亮氨酸
核糖体随着
mRNA滑动.
另一个
tRNA上的碱基与mRNA上的密码子配对.
UCAUGAUUA
亮氨酸ACU
天门冬酰氨AUG
异亮氨酸
一个个氨基酸分子缩合成链状结构UCAUGAUUA
亮氨酸ACU
天门冬酰氨AUG
异亮氨酸tRNA离开,再去转运新的氨基酸UCAUGAUUA
亮氨酸
天门冬酰氨
异亮氨酸以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质体外核糖体展示肽库构建与筛选原理示意图体外转录和翻译
体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。①亲和筛选分为固相筛选和液相筛选,主要有ELISA和磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中,抗原包被在塑料表面上,而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象,从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签,如生物素,然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。SRP受体核糖体受体蛋白质移位子mRNAtRNASRP蛋白质合成装置通过SRP与其受体的结合移位到内质网膜上信号肽与SRP结合导致蛋白质合成暂停SRP解离再循环蛋白质合成继续,并开始转位信号肽信号假说与蛋白质合成Blobel及其同事在上世纪60年代末,利用免疫球蛋白重链mRNA进行(离体)无细胞体系合成实验,发现:(1)如果在离体体系加入微粒体,新生多肽可进入微粒体内;(2)进入微粒体的多肽较无微粒体体系合成的多肽在氨基端截断了一段。他们认为这段多肽起到了某种信号作用,由此提出了信号假说。
游离核糖体如何成为结合核糖体?新生多肽链是如何穿越内质网膜?
信号假说与信号肽(signalpeptide)信号肽存在于分泌蛋白N-端或跨膜蛋白多肽链内部;由大约16~30个疏水氨基酸残基组成;可被细胞质内的信号识别颗粒(SRP)特异识别并结合。信号假说:蛋白质的合成起始于细胞质溶胶中的核糖体,通过新生肽链上的信号肽将核糖体引导到内质网膜上,并在内质网中完成蛋白质的合成,而信号肽本身则在蛋白质合成完成之前就被内质网腔的信号肽酶切除。
一、蛋白的分选蛋白的信号:信号序列(signalsequence):存在于蛋白质一级结构上的线性序列,通常15-60个氨基酸残基,每一种信号序列决定特殊的蛋白质转运方向。信号斑(signalpatch):存在于完成折叠的蛋白质中,构成信号斑的信号序列之间可以不相邻,折叠在一起构成蛋白质分选的信号。信号肽(signalpeptide)
信号肽存在于分泌蛋白、溶酶体酶蛋白的N-端或跨膜蛋白多肽链内部,跨膜蛋白内部的信号肽还兼有停止转运序列功能;信号肽由大约18~30个疏水氨基酸残基组成,可被细胞质内的信号识别颗粒(SRP)特异识别并结合,从而引起新生多肽链合成暂停。返回信号肽的结构
信号肽的一级序列信号肽一级序列由疏水核心(h)、C端(c)和N端(n)三个区域构成。以血清白蛋白和HIV-1型病毒的糖蛋白gp160信号肽为例,显示出两者的n区长度明显不同信号假说的组成成分信号肽(signalpeptide);位于分泌蛋白N端,由16~30个氨基酸组成,分为N端、疏水核心区及C端。信号识别颗粒(SRP):能识别信号肽的蛋白,由6条多肽和一个7SRNA组成的复合物。信号识别蛋白受体(SRP受体或停泊蛋白DP):为SRP受体,位于内质网膜上。信号识别颗粒(signalrecognitionparticles,SRP)
信号识别颗粒(SRP)存在于细胞质内,由6种多肽亚单位和小分子量的细胞质RNA(7SLRNA)组成,其化学本质是一种RNP。SRP具有三个功能区:信号肽结合位点、翻译暂停区和SRP受体结合区。SRP可识别新生多肽链上的信号肽,并与蛋白质合成机器结合而致蛋白质合成暂停。SRP可被ER膜上的SRP受体特异识别、结合。返回信号识别颗粒(signal-recognitionparticle,SRP)SRPcomprisesone300-nucleotideRNAandsixproteinsdesignatedP9,P14,P19,P54,P68,andP72.(Thenumberindicatesthemolecularweightx10-3).核糖体受体(ribosomalreceptor,Ribophorin)
核糖体受体亦称核糖体连接蛋白(ribophorin),是ER膜上一种特异的糖蛋白,是位于ER膜上细胞质面的膜整合蛋白。核糖体受体可分为两种类型:I型(mw.65kd)和II型(mw.63kd)。通过核糖体大亚基上的膜结合位点,介导核糖体与ER膜结合。返回SRP受体核糖体受体蛋白质移位子mRNAtRNASRP蛋白质合成装置通过SRP与其受体的结合移位到内质网膜上信号肽与SRP结合导致蛋白质合成暂停SRP解离再循环蛋白质合成继续,并开始转位信号肽信号假说与蛋白质合成Blobel及其同事在上世纪60年代末,利用免疫球蛋白重链mRNA进行(离体)无细胞体系合成实验,发现:(1)如果在离体体系加入微粒体,新生多肽可进入微粒体内;(2)进入微粒体的多肽较无微粒体体系合成的多肽在氨基端截断了一段。他们认为这段多肽起到了某种信号作用,由此提出了信号假说。
游离核糖体如何成为结合核糖体?新生多肽链是如何穿越内质网膜?蛋白质合成后信号肽被酶切除
核糖体在蛋白质合成启动后,由mRNA在特定的信号顺序编码首先合成一段肽链-信号肽,它作为与rER膜结合的“引导者”指引核糖体与rER膜结合,并决定新生肽链插入膜内进入内腔,起协同翻译的转运作用。信号识别颗粒(SRP)是一种核糖体酸蛋白质复合体,存在于细胞质中。当信号肽露出核糖体,SRP的疏水部分与信号肽疏水部分结合,另一部分与核糖体结合,肽链合成暂时停止。SRP-信号肽-核糖体复合物收SRP介导引向rER膜上受体,并与之结合。当核糖体接触到rER膜面时,大亚基即附着在膜上转位装置上,可能由于蛋白质转位装置各成分的集聚,形成膜通道使新生肽链插入rER腔。结合后暂时停止的肽链合成又恢复,新生肽链尾随信号肽续延伸。当信号肽的作用完成后,即被内质网上的信号肽酶切除,肽链继续合成延伸。当遇到终止密码时,蛋白质合成终止。新生肽链完全转入rER腔。与此同时,核糖体大小亚基分离,大亚基从rER膜上脱离,游离在胞质中以供循环使用。信号假说与新生多肽链的跨内质网膜行为信号假说多肽链开始在游离核糖体上合成,信号密码子转译信号肽(约有15-30个氨基酸);信号识别蛋白(signalrecognitionprotein,SRP)识别正在合成信号肽的核糖体,并与之结合,多肽链合成暂停;SRP与ER膜上的SRP受体(又称停泊蛋白)结合,多肽链合成继续。SRP脱离释放返回基质重复利用。(此步消耗GTP).信号肽与ER膜上的易位子作用并使ER形成通道,合成的多肽链通过通道进入内质网池。(rER上的蛋白复合体,直径8.5nm,中心为2nm的通道,主要成分是Sec61p蛋白).信号肽被位于ER膜内表面的信号肽酶(Signalpeptidase)切掉。多肽链继续伸长,直至合成完毕。在一种分离因子作用下,通道封闭蛋白转入内质网合成示意图多肽链开始在游离核糖体上合成,信号密码子转译信号肽信号识别蛋白识别并结合正在合成信号肽的核糖体,多肽链合成暂停;SRP与ER膜上的SRP受体(又称停泊蛋白)结合,多肽链合成继续。与ER膜上的易位子作用并使ER形成通道,合成的多肽链进入内质网池。信号肽被位于ER膜内表面的信号肽酶(Signalpeptidase)切掉。不同类跨膜蛋白所含这两种序列的情况及其合成情况:
一次跨膜的蛋白,开始转移序列位于N’端,且N端进入ER腔内
这类的停止转移序列位于膜链内部。停止序列及其之前部分的合成和转移与分泌蛋白相同。其开始序列即信号肽最后亦被切除分解。但停止序列以后的肽链一般都不转移进ER腔。共转移与后转移共转移:肽链边合成边转移的方式由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列,又称开始转移序列(starttransfer
sequence);起始转移序列——信号肽停止转移系列——与膜紧密结合不转移至ER腔的序列
起始转移序列和停止转移系列决定蛋白的跨膜情况后转移:蛋白合成完成后再转移的方式如线粒体蛋白其指导转移的序列称导肽转移序列与蛋白的跨膜结构
多次跨膜蛋白与单次跨膜蛋白的不同之处是,它们有多个“开始序列”和“停止序列”。
信号肽的一级结构10-15α-螺旋蛋白质的修饰与加工包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等,其中最主要的是糖基化,几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。糖基化的作用:使蛋白质能够抵抗消化酶的作用;赋予蛋白质传导信号的功能;某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。在进化上,寡糖链具有一定的刚性,从而限制了其它大分子接近细胞表面的膜蛋白,这就可能使真核细胞的祖先具有一个保护性的外被,同时又不象细胞壁那样限制细胞的形状与运动。粗面内质网的功能内质网上进行N-连接的糖基化。N-连接的糖基化(N-linkedglycosylation):与天冬酰胺残基的NH2连接,糖为N-乙酰葡糖胺。ProteinglycosylationinRER粗面内质网的功能新生多肽的折叠与装配二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI:ER驻留蛋白)催化新合成的蛋白形成和改组二硫键,形成正确的折叠状态。分子伴侣BiP(Bindingprotein)识别错误折叠的蛋白或未装配好的蛋白亚单位,并促进重新折叠与装配。不能正确折叠的畸形肽链或未装配成寡聚体的蛋白质亚单位,不能进入高尔基体。这些多肽一旦被识别,便从内质网腔转至细胞质基质(通过Sec61p复合体),被蛋白酶体(proteasomes-protein-degradingmachine)所降解。(seenext)粗面内质网的功能装配辅助因子分子伴侣(molecularchaperones):细胞中的某些蛋白质分子可以识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的某些部位相结合,从而帮助这些多肽转运、折叠或装配,这一类分子本身并不参与最终产物的形成,因此称为分子“伴侣”。
放射自显影技术追踪分泌蛋白转运途径粗面内质网的功能
分泌蛋白质的合成
1.信号肽引导核糖体结合到内质网膜
2.新生肽链到内质网腔的跨膜转运
3.蛋白质在内质网腔内的折叠
4.蛋白质在内质网腔内的糖基化
5.蛋白质由内质网向高尔基复合体的运输
膜整合蛋白质的嵌插机制附着型核糖体
粗面内质网的功能之一:蛋白质的合成附着型核糖体是如何附着到内质网膜上的?分泌蛋白驻留蛋白膜蛋白内质网合成的新生蛋白质是如何转移到内质网网腔中的?
核糖体由两个亚基构成,在不进行蛋白质合成时,它们各自游离于细胞质中;核糖体有两种状态:游离核糖体和附着核糖体。蛋白质合成都起始于胞质溶胶,mRNA与核糖体大小亚基形成游离核糖体,随着蛋白质合成过程的进行,有些游离核糖体会贴附于内质网膜上成为附着核糖体,有些则仍然保持游离状态WithsignalsequenceWithoutsignalsequenceThetypesofproteins(BB)Thetypesofproteins(BB)粗面内质网的功能之二:蛋白质的折叠与装配分子伴侣:这类蛋白能特异性地识别新生肽链或部分折叠的多肽并与之结合,帮助这些多肽正确折叠形成高级结构,但其本身并不参与最终产物的形成,只起陪伴作用。分子伴侣还能检查多肽的折叠状态,可以识别并结合错误折叠的多肽,把它们滞留在内质网腔中。内质网中的分子伴侣具有内质网驻留信号(KDEL),能够长期、稳定地停留在内质网中。几种典型的蛋白分选信号信号功能信号序列蛋白进入ER+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Ler-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-滞留在ER中Lys-Asp-Glu-Leu-COO-蛋白进入线粒体H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-进入细胞核Pro-Pro-Lys-Lys-Arg-Lys-Val进入过氧化物酶体Ser-Lys-Leu-粗面内质网的功能之三:蛋白质的糖基化内质网的N-连接糖基化内质网内蛋白质的糖基化发生在特异性的三肽序列:Asn-X-Thr/Ser(X示任意氨基酸)糖基结合在该序列中Asn的-NH2上,这一过程称为N-连接糖基化。粗面内质网的功能之四:蛋白质的胞内运输分泌性蛋白、驻留蛋白、跨膜蛋白进入内质网网腔或成为内质网跨膜蛋白后,将会被包装形成膜泡,并由内质网出芽,转运至高尔基体。粗面内质网滑面内质网蛋白质的合成蛋白质的糖基化修饰蛋白质的折叠与装配脂质、类固醇激素的合成糖原的代谢解毒作用
内质网(endoplasmicreticulum,ER)Ca2+储存场所内质网的化学组成内质网的形态结构内质网的基本类型内质网的功能蛋白质的胞内运输内质网的形态结构高尔基体高尔基体(Golgibody),也称高尔基器(Golgiapparatus)或高尔基复合体(Golgicomplex)最早发现于1855年,1889年,Golgi用银染法,在猫头鹰的神经细胞内观察到了清晰的结构,因此定名为高尔基体。20世纪50年代以后才正确认识它的存在和结构。1909年诺贝尔奖。GolgiApparatusinaplantparenchymacellfromSauromatumguttatum(TEMx145,700).真核细胞的内膜系统内膜系统成员返回上一层高尔基体(Golgicomplex,Golgi)高尔基体的形态结构高尔基体的化学组成高尔基体的主要功能
高尔基复合体(Golgicomplex)广泛分布于除成熟红细胞以外的所有真核细胞中由单层膜构成的囊泡结构复合体按囊泡形态可为三个组成部分:
1、扁平囊泡(主体结构)
2、小囊泡(位于顺面)
3、大囊泡(位于反面)是一个具有极性的细胞器,可分为顺面高尔基网络(小囊泡)、中间膜囊(扁平囊泡)和反面高尔基网络(大囊泡)不同类型的细胞有不同的分布形式高尔基复合体的形态结构高尔基复合体的化学组成高尔基复合体的功能高尔基复合体的形态高尔基复合体由一层单位膜构成,其基本形态包括小囊泡、扁平囊和大囊泡,按极性分布可分为顺面高尔基网络、中间膜囊及反面高尔基网络,每个区都有独特的酶,执行特定的功能。
大囊泡
小囊泡
扁平囊高尔基复合体的形态
高尔基体由一层单位膜构成,其基本形态包括小泡、扁平囊和大泡。根据现代研究,一般把它分为顺面高尔基网络、扁平囊区以及反面高尔基网络,中间的扁平囊区又可分为顺面扁囊、中间扁囊和反面扁囊,每个生化区室都具有独特的酶系,执行特定的功能。1、形态和组成CGN最内侧称高尔基体顺面网络结构(cisGolginetwork,CGN),呈相互连接的管网结构(interconnectednetworkoftubules),是高尔基体的入口区域。DiagramofGolgibody.Vesiclesarriveatthecisfaceandleavefromtransface.Theinternalcompartmentofeachmembranesaciscalleda“cisterna”(pl.cisternae).GolgiStack:高尔基体的主体由一系列大的、扁平膜囊和管道组成,形成不同间隔,但功能上是连续的。可分为顺面膜囊(ciscisternae)、中间膜囊(medialcisternae)和反面膜囊(transcisternae)。多数糖基化修饰、糖脂的形成以及与高尔基体有关的多糖的合成都发生在此。1、形态和组成TGN:反面最外测称高尔基体反面网络结构(transGolginetwork,TGN),呈管网状,并有囊泡与之相连。是高尔基体的出口区域,功能是参与蛋白质的分类与包装,最后输出。1、形态和组成高尔基复合体的形态结构高尔基复合体的化学组成高尔基复合体的功能
高尔基复合体(Golgicomplex)同普通生物膜一样,高尔基复合体也是由脂类和蛋白质组成高尔基复合体的酶:糖基转移酶(标志酶)种类功能糖基转移酶参与糖蛋白合成唾液酸转移酶、UDP-半乳糖:N-乙酰葡萄糖胺半乳糖基转移酶、糖蛋白-半乳糖转移酶,等磺基糖基转移酶参与糖脂合成半乳糖脑苷脂硫酸转移酶、CMP-NANA:GM1唾液酸基转移酶、CMP-NANA:唾液酸基转移酶,等转移酶参与磷脂合成溶血卵磷脂酰基转移酶、磷脂甘油磷脂酰转移酶,等氧化还原酶NADH-细胞色素c还原酶、NADPH-细胞色素还原酶,等磷酸酶5-核苷酸酶、腺苷三磷酸酶、硫胺素焦磷酸酶,等激酶酪蛋白磷酸激酶,等甘露糖苷酶-甘露糖苷酶,等磷脂酶磷脂酶A1、磷脂酶A2高尔基体的酶2、高尔基体的功能蛋白质运输和分选(sorting)蛋白质修饰水解糖基化硫酸化:蛋白聚糖膜循环:内质网上合成的脂质一部分转移至高尔基体后,经过修饰和加工,形成运输泡,向细胞膜和溶酶体膜等部位运输。高尔基体的主要功能是将内质网合成的多种蛋白质进行加工、分类与包装,然后分门别类地运送到细胞特定的部位或分泌到细胞外蛋白质化学修饰两种类型的糖基化:N-连接型糖基化和O-连接型糖基化;糖蛋白的精细加工;充分体现糖蛋白的多样性。
高尔基体中蛋白质糖基化发生在扁平囊的非胞质面,核苷酸单糖通过载体蛋白进入高尔基体扁平囊,在特异的糖基转移酶作用下,连接到多肽链中的Ser/Thr/HyLys/HyPro残基的-OH上(故称为O-连接型糖基化),最后加入唾液酸残基。除糖蛋白外,蛋白聚糖的装配也在高尔基体进行的。高尔基体对糖蛋白的精细加工2、高尔基体的功能O-连接的糖基化
O-连接的糖基化在高尔基体中进行,糖的供体为核苷糖(半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)。将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基上。N-连接的寡聚糖进一步加工内质网上:磷酸多萜醇上的糖基转移到多肽的天冬酰胺(Asn)上高尔基体:加工,切除葡萄糖和部分甘露糖分子,添加特定的单糖,形成成熟的糖蛋白高尔基复合体对糖蛋白的精细加工高尔基复合体的每个扁囊都具有自己独特的糖基转移酶,蛋白质每经过一个扁囊都进行了一次加工。对糖蛋白而言,这种加工主要是去除某些单糖残基,加入另外一些单糖分子,从而表现出糖蛋白的多样性。内质网高尔基体高尔基体中的蛋白质糖基化
高尔基体中蛋白质糖基化发生在扁平囊的非胞质面,核苷酸单糖通过载体蛋白进入高尔基体扁平囊,在特异的糖基转移酶作用下,连接到多肽链中的Ser/Thr/HyLys/HyPro残基的-OH上(故称为O-连接型糖基化),最后加入唾液酸残基。除糖蛋白外,蛋白聚糖的装配也在高尔基体进行的。真核细胞的内膜系统内膜系统成员高尔基体的主要功能蛋白质化学修饰蛋白质加工改造蛋白质分拣运输生物膜成分更新蛋白质在高尔基体中酶解加工无生物活性的蛋白原(proprotein)高尔基体切除N-端或两端的序列成熟的多肽。如胰岛素、胰高血糖素及血清白蛋白等。蛋白质前体高尔基体水解同种有活性的多肽,如神经肽等。含有不同信号序列的蛋白质前体高尔基体加工成不同的产物。同一种蛋白质前体不同细胞、以不同的方式加工不同的多肽。
某些没有生物活性的蛋白原进入高尔基体扁平囊后,在蛋白酶作用下,将蛋白质N-端或两端甚至肽链内部某些序列切除形成成熟多肽,如白蛋白、胰岛素、胰高血糖素以及神经肽等。这些成熟蛋白可直接分泌到细胞外(如白蛋白),或通过神经或体液信号分泌到细胞外(如胰岛素)。高尔基体对蛋白原的加工蛋白原的水解成熟
实例:胰岛素原多余肽段的水解、二硫键的形成,空间结构的正确形成2、蛋白质的水解加工高尔基复合体的功能之一:细胞内物质加工合成的重要场所真核细胞的内膜系统内膜系统成员高尔基体的主要功能蛋白质化学修饰蛋白质加工改造蛋白质分拣运输生物膜成分更新真核细胞的内膜系统内膜系统成员返回上一层溶酶体(lysosome)溶酶体的形态结构溶酶体的基本类型溶酶体的化学组成溶酶体的基本功能真核细胞的内膜系统内膜系统成员溶酶体的形态结构广泛分布于除成熟红细胞以外的所有真核细胞中;细胞的“消化器官”、“清道夫”;由一层单位膜形成的囊泡状结构;富含酸性水解酶(最适pH=5):酸性磷酸酶(标志酶)。Thelysosomeslooklike
storagegranules
inshapeandtakemanyforms.LysosomescanvarywidelyinsizeSotheyarecalledheterotypeorganelles.Lysosomescontainmorethan30definedhydrolyticenzymes(acidhydrolases)thatbreakdownmacromoleculessuchasnucleicacids,proteins,andpolysaccharides.So,Lysosomesarecells’garbagedisposalsystem.MembranousorganellecontaininglargequantitiesofhydrolyticenzymesTherearemoreglycoproteinsandtheyarehighlyglycosylation,whichtheoligosaccharidesaretowardstheinnersurfaceofmembraneprotectingthemembraneitselffromdegradationbyitsownenzymes.溶酶体的超微结构
溶酶体内含有多种水解酶,目前发现有60多种水解酶,绝大多数是酸性水解酶,最适pH大约在4~6。溶酶体中的水解酶主要包括核酸酶、蛋白酶、核苷酶、脂酶、磷酸酶和硫酸脂酶等六大类。其中酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。组织化学多采用Gomori方法显示。溶酶体的酶
初级溶酶体(primarylysosome)直径约0.2~0.5um,有多种酸性水解酶,但没有活性,包括蛋白酶,核酸酶、脂酶、磷酸酶等60余种,反应的最适PH值为5左右。溶酶体的类型Secondarylysosome次级溶酶体(secondarylysosome)是正在进行或完成消化作用的溶酶体,内含水解酶和相应的底物,可分为自噬溶酶体(autophagolysosome)和异噬溶酶体(phagolysosome)。肝细胞脂褐质残体(residualbody)又称后溶酶体(post-lysosome)已失去酶活性,仅留未消化的残渣,故名。残体可通过外排作用排出细胞,也可能留在细胞内逐年增多,如表皮细胞的老年斑,肝细胞的脂褐质。溶酶体的功能细胞内消化:如高等动物内吞低密脂蛋白获得胆固醇,单细胞真核生物利用溶酶体消化食物。自体吞噬:清除无用的生物大分子,衰老细胞、细胞器、个体发育中多余的细胞。许多生物大分子的半衰期只有几小时至几天,肝细胞中线粒体的平均寿命约10天左右。防御作用:如巨噬细胞杀死病原体。参与分泌过程的调节:如将甲状腺球蛋白降解成有活性的甲状腺素。形成精子的顶体。溶酶体的发生在高尔基体的trans面以出芽的方式形成:前溶酶体蛋白→N-连接的糖基化→高尔基体→磷酸转移酶识别信号斑→将N-乙酰葡糖胺磷酸转移在1~2个甘露糖残基上→在中间膜囊切去N-乙酰葡糖胺形成M6P配体→与trans膜囊上M6P受体结合→通过clathrin衣被包装成运输小泡→与晚期的内体融合,受体解离→切除甘露糖残基上的磷酸。
溶酶体蛋白酶前体在内质网腔糖基化,加上含有甘露糖的低聚糖链,后者通过转运囊泡转移到高尔基体顺面扁囊。在高尔基体顺面扁囊,酶蛋白前体低聚糖链中的甘露糖残基被磷酸化,形成6-磷酸甘露糖,磷酸化后的蛋白酶前体逐级通过扁平囊加工、修饰,最终成为成熟蛋白。高尔基体反面扁囊存在6-磷酸甘露糖的受体,后者与酶蛋白低聚糖链上的6-甘露糖通过识别、结合,形成有被小泡;有被小泡脱衣被后与细胞质内酸性囊泡(内体)融和形成大囊泡。在融和囊泡内,因酸性环境导致6-磷酸甘露糖与其受体分离,形成空载的受体囊泡和含酶蛋白的囊泡。受体囊泡返回高尔基体循环再利用,酶蛋白小泡内6-磷酸甘露糖去磷酸化,最终形成成熟的溶酶体酶蛋白。
溶酶体酶蛋白的分拣运输细胞内蛋白质的分选与膜泡运输蛋白质分选(Proteinsorting):Proteinmoleculesmovefromthecytosoltotheirtargetorganellesorcellsurfacedirectedbythesortingsignalsintheproteins一、蛋白质分选的基本途径与类型蛋白质分选的两条途径细胞质基质线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核粗面内质网溶酶体、细胞膜、分泌到细胞外、留在高尔基体和内质网中高尔基体蛋白质分选的三种机制:GatedTransport:TransportthroughnuclearporesTransmembranetransport:ER,Mit,Chl,PerVesiculartransport:ER-Golgi-Lys,Endosome,PM,细胞核蛋白的靶向输送-----选择性的门控转运目录肽链转位,输入因子解聚4-8氨基酸GTPase二、蛋白质分选的原理细胞内合成的蛋白质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面:其一是蛋白质中包含特殊的信号其二是细胞器上具特定的信号识别装置(分选受体,sortingreceptor)。1、蛋白质分选信号信号序列(signalsequence):存在于蛋白质一级结构上的线性序列,通常15-60个氨基酸残基;信号序列对所引导的蛋白质没有特异性要求信号肽导肽信号斑(signalpatch):存在于完成折叠的蛋白质中,构成信号斑的信号序列之间可以不相邻,折叠在一起构成蛋白质分选的信号。signalsequenceandsignalpatch几种典型的蛋白分选信号信号功能信号序列蛋白进入ER+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Ler-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-滞留在ER中Lys-Asp-Glu-Leu-COO-蛋白进入线粒体H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-进入细胞核Pro-Pro-Lys-Lys-Arg-Lys-Val进入过氧化物酶体Ser-Lys-Leu-3.共转移与后转移共转移:肽链边合成边转移的方式由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列,又称开始转移序列(starttransfer
sequence);起始转移序列——信号肽停止转移系列——与膜紧密结合不转移至ER腔的序列
起始转移序列和停止转移系列决定蛋白的跨膜情况后转移:蛋白合成完成后再转移的方式如线粒体蛋白其指导转移的序列称导肽共转移(cotranslocation):肽链在粗面内质网膜上边合成边转移到内质网腔中信号肽序列被信号肽酶切除→完全进入腔若有停止转移信号(stoptransfersequence,与内质网膜有极强的亲合力):形成跨膜蛋白线粒体和叶绿体蛋白质的运送与组装后转移(posttranslocation):蛋白质在细胞质基质中合成以后在某种信号指导下再转移到线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等细胞器中的转移方式.这类信号序列称导肽(leaderpeptide)或转运肽(transitpeptides):线粒体蛋白质在细胞质基质中合成起始阶段形成的N-端的信号序列。20-80个氨基酸残基含有丰富的带正电荷的碱性氨基酸,特别是精氨酸,有助于前导肽进入带负电荷的基质中。羟基氨基酸含量也高几乎不含带负电荷的酸性氨基酸可形成既具亲水性又具疏水性的a螺旋结构定位于线粒体基质的蛋白质的运送线粒体蛋白的靶向输送导肽Hsp60替换Hsp70定位于线粒体内膜或膜间隙的蛋白质运送叶绿体蛋白质的运送及组装SomeSignalSequencesFunction
of
Signal ExampleofSignalSequence ImportintoER +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly- Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys- Cys-Glu-Val-Phe-Gln-RetentioninlumenofER -Lys-Asp-Glu-Leu-COO-Importintomitochondria +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe- Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr- Leu-Leu-Importintonucleus -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Importintoperoxisomes -Ser-Lys-Leu-Positivelychargedaminoacidsareshowninred,andnegativelychargedaminoacidsingreen.Anextendedblockofhydrophobicaminoacidsisshowninblue.
+H3Nindicatestheaminoterminusofaprotein;COO-indicatesthecarboxylterminus.三、胞内膜泡运输膜泡是被包被的大多数运输小泡是在膜的特定区域以出芽的方式产生的。其表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被(coat)。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。衣被类型:已知三类COPIICOPI网格蛋白(clathrin)主要作用:选择性的将特定蛋白聚集在一起,形成运输小泡如同模具一样决定运输小泡的外部特征马达蛋白牵引衣被小泡沿微管运输在马达蛋白(motorprotein)的牵引下,可将膜泡运到特定的区域胞质中微管motorprotein分为两大类:驱动蛋白(kinesin),趋向微管正极;动力蛋白(dynein),趋向微管负极;三、胞内膜泡运输1、COPⅡ衣被小泡运输途径:介导从内质网到高尔基体的物质运输。COPII衣被由多种蛋白质构成,Sec23/Sec24复合体在内,Sec13/Sec31复合体覆盖在外层。大多数被运输的跨膜蛋白是直接结合在COPII衣被上,少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COPII衣被结合。分选信号位于跨膜蛋白胞质面的结构域,形式多样COPIIVesicles2、COPI衣被小泡功能:负责回收、转运内质网逃逸蛋白(escapedproteins)返回内质网回收信号,即内质网驻留信号(ERretentionsignal):Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL)。COPI还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。ER驻留蛋白的运输高尔基体膜:有识别KDEL信号的受体,形成小泡,将逃逸的蛋白送回内质网膜蛋白(如SRP受体)在C端有一个不同的回收信号,通常是Lys-Lys-X-X(KKXX),能与COPI包被识别结合。Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL)CopIVesiclesCOPI由7种蛋白组成,COPαββ’γδεζ,
CopIandCopIIVesicles3、网格蛋白有被小泡相关运输途径:质膜→内体,高尔基体→内体,高尔基体→溶酶体、植物液泡。网格蛋白(clathrin)结构:由3个重链和3个轻链组成,形成一个具有3个曲臂的形状。许多网格蛋白的曲臂部分交织在一起,形成具有5边形网孔的笼子。ClathrincoatedvesiclesSelectivetransportbyclathrincoatedvesicles衔接蛋白(adaptin):介于网格蛋白与配体受体复合物之间,起连接作用。目前至少发现4种,分别结合不同类型的受体,形成不同性质的转运小泡。
当网格蛋白有被小泡形成时,可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的颈部,将小泡柄部的膜尽可能地拉近(小于1.5nm),从而导致膜融合,掐断(pinchoff)衣被小泡。4、coat-recruitmentGTPase衣被是在coat-recruitmentGTPase(为单体GTPase,monomericGTPase)作用下形成的。coat-recruitmentGTPase存在于细胞质中,但处于结合GDP的失活状态。衣被小泡形成时,释放GDP,结合GTP而激活。调节因子有:鸟苷酸交换因子(guanine-nucleotideexchangefactor,GEF)GTP酶激活蛋白(GTPaseactivatingprotein,GAP)。当衣被小泡从膜上释放后,衣被很快就解体。coat-recruitmentGTPase包括ARF蛋白和SAR1蛋白。ARF参与高尔基体上网格蛋白衣被与COPI衣被的形成。SAR1参与内质网上COPII衣被的形成。COPIICoatedvesicleCOPIICoatassembly三种衣被小泡的组成和功能衣被类型GTP酶组成与衔接蛋白运输方向clathrinARFClathrin重链与轻链,AP2质膜→内体Clathrin重链与轻链,AP1高尔基体→内体Clathrin重链与轻链,AP3高尔基体→溶酶体,植物液泡COPIARFCOPαββ’
γδεζ高尔基体→内质网COPIISar1Sec23/Sec24复合体,Sec13/31复合体,Sec16内质网→高尔基体根据胞吞的物质是否具有专一性,胞吞作用分为:非特异性胞吞作用受体介导的胞吞作用(Receptor-mediatedendocytosis):是大多数动物细胞通过网格蛋白有被小泡从胞外基质摄取特定大分子的有效途径。5、受体介导的胞吞作用受体介导的胞吞过程配体(Ligand):营养物有害物质免疫物质信号物质6、胞吐途径组成型的胞吐途径(constitutiveexocytosispathway)所有真核细胞连续分泌过程用于质膜更新(膜脂、膜蛋白),胞外基质组分、营养或信号分子分泌defaultpathway:除某些有特殊标志的駐留蛋白和调节的分泌泡外,其余蛋白的转运途径:粗面内质网→高尔基体→分泌泡→细胞表面6、胞吐途径调节型外排途径(regulatedexocytosispathway)特化的分泌细胞储存——刺激——释放产生分泌物(如激素、粘液或消化酶)具有共同的分选机制,分选信号存在于蛋白本身,分选主要由高尔基体TGN上的受体类蛋白来决定囊泡与囊泡转运
网格蛋白有被小泡,有两个来源:1、高尔基体反面囊泡出芽,向溶酶体及细胞外转运物质2、受体介导的内吞作用,将外来物质转运至细胞内
COPⅡ有被小泡:来源与粗面内质网,负责从内质网到高尔基复合体的物质转运
COPⅠ有被小泡:来源于高尔基体,主要负责回收内质网逃逸蛋白网格蛋白COPICOPII网格蛋白囊泡的来源与类型7、溶酶体的发生初级溶酶体是在高尔基体的trans面以出芽的形式形成Transportofnewlysynthesizedhydrolasestolysosomes高尔基体TGN通过对M6P的识别将溶酶体的酶分选出来溶酶体的酶上都有一个特殊的标记∶6-磷酸甘露糖(M6P)7、溶酶体的发生TargetingofsolublelysosomalenzymestoendosomesandlysosomesbyM-6-Ptag
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