细胞培养工程01绪论

1课程安排以蛋白质药物基因表达的细胞培养过程为主线：课堂教学考虑安排实验操作训练教材：中文教材更新慢，以课件为主，参考书自选一本。考试成绩：考勤：10%考试方式（二选一，同学表决）：90%开卷考试（以课件内容为主）自选相关题目演讲第一页，共71页。2教学计划1绪论细胞结构与生理42细胞培养基43细胞培养理论44生物反应器-传动现象45生物反应器-传质现象46细胞培养模式与调控47生物反应器控制理论48发酵工程（或蛋白质纯化）

考试4第二页，共71页。细胞培养工程南开大学药学院3动物细胞培养过程张元兴等2007参考书动物细胞培养基本技术指南(第5版)

BioprocessEngineeringPrinciplesPaulineM.Doran1995BasicBioreactorDesignvan'tRiet&Tramper1991CellCultureBioprocessEngineeringWei-ShouHu2012细胞培养工程元英进2012第三页，共71页。4第四页，共71页。绪论5第五页，共71页。根据中华人民共和国药典，药品分三类中药化学药生物制药（目前主要是蛋白质药物、疫苗等）美国FDA将药品也分三类为小分子药物（化学药）大分子药物（蛋白质药物、疫苗等）细胞药物（干细胞、组织工程、免疫治疗等）2.&3.皆为生物药6第六页，共71页。7后现代药学发展理念生命科学的快速发展，推动了以化学为主体的传统药学研究模式向以生命科学与化学相结合的新模式转变；以分子生物学和细胞生物学为代表的现代生物学基础研究与生物技术实践虽然只有短短几十年，对新药（包括大分子药物和细胞）的发现、研究、生产、质量管理和药品临床应用等方面均产生了重要影响；以现代生物技术手段生产的蛋白质多肽类药物在临床上的成功应用，使医药生物技术成为生物技术领域发展最快、效益最高、最有发展前景的应用领域；动物细胞培养工程是衔接现代生物学理论、新发现与化学工程原理，并应用于复杂蛋白质药物研发、生产和新型细胞治疗技术的关键环节和重要技术手段。7第七页，共71页。动物细胞培养8在体外培养动物细胞的专门技术，即在无菌条件下，（1）从机体中取出组织或细胞（原代细胞），或（2）利用已经建立的动物细胞系（细胞株），在模拟机体内生理状态的基本环境条件下，让细胞在培养容器（培养皿或生物反应器）中生存、生长和繁殖的方法；基础研究：细胞培养在现代生物学研究中广泛使用、不可或

缺的实验技术；生物产业：大规模商业化生产。第八页，共71页。99细胞培养：基础研究应用第九页，共71页。细胞培养：基础研究应用简化环境条件，排除体内实验复杂影响因素，便于应用生物、物理、化学等外界因素，探索和揭示细胞生命活动的基本规律；便于应用各种技术和方法，研究和观察细胞结构与功能的变化；通常采用小型培养容器（如培养皿，96孔板等），培养基一般含有动物血清（如小牛血清，5-20%），细胞贴壁，静止培养。10第十页，共71页。细胞培养：医药研发应用现代新型药物开发必须依循生物学原理（生理作用机制），并尽可能利用（1）相关药物作用靶点（生物大分子，目前主要是蛋白质如鸦片受体）或（2）载有靶点的工具细胞为评估对象，减少药物发现的盲目性，提高药物设计与筛选效率；药物作用的细胞模型（具有商业价值）减少实验动物的使用使药物筛选微型化、高通量化、自动化，使信息采集效率大幅提高11第十一页，共71页。细胞培养工程12细胞培养工程是以动物细胞为对象，研究在体外培养环境中细胞生长与产物合成的关系（动力学），并利用化学工程原理指导优化生物反应器的搅拌、通氧、反应器操作模式以及培养环境控制，关乎产物质量（大分子药物质量标准远比小分子复杂）、生产效率、生产成本；细胞培养工程是应用大规模细胞培养技术从事生产过程工艺开发和过程放大的重要工程理论。大规模生产过程（上千升或更大）将细胞至于完全不同的生长环境，细胞在可控的生长环境中（生物反应器）经历机械搅拌、通氧并对环境做出生理调整。如何控制细胞生长环境以满足细胞生理需求、达到最高生产效率，需要化学工程原理与细胞生理的紧密结合。第十二页，共71页。1313大规模细胞培养技术目前生物制品商业化生产的最重要工业技术，使众多疾病得到前所未有的治疗蛋白药物：抗体，血液蛋白，细胞因子，疫苗病毒：疫苗，基因治疗载体细胞治疗与再生医学等新兴治疗直接受益干细胞与组织工程原代细胞体外扩增与分化组织工程部件体外构建细胞治疗：免疫治疗等第十三页，共71页。大规模细胞培养技术的发展脉络组织与细胞培养病毒疫苗细胞天然分泌物有血清贴壁培养生化制药脏器药物提取胰岛素，白蛋白等深层发酵技术（搅拌，通氧）WWII，开启抗生素、氨基酸、维生素、酶等新工业重组人蛋白质表达（E.coli）胰岛素，生长激素，G-CSF，-干扰素，淋巴介素-2高分子量基因可能有问题缺乏翻译后修饰，尤其是二硫键连接与糖基化微生物发酵厌氧发酵技术WWI，有机溶剂（炸药干燥）多种反应器设计无血清培养基研发无血清悬浮培养重病毒疫苗组人蛋白质表达翻译后修饰大规模无血清悬浮重组人蛋白质表达病毒疫苗改进搅拌式反应器设计解决细胞损伤无细胞（Cellfree）蛋白质表达E.coli胞浆加入伴侣蛋白可以二硫键连接第十四页，共71页。生物制药历史回顾生物技术发展简史疫苗生化制药（脏器药物）15第十五页，共71页。生物技术发展简史：传统生物技术

人类传统酿造技术有数千年历史，但直到显微镜的发明，人类才获知微生物的存在，并进一步获知“酵素”（酶）的存在；工业微生物：19世纪末到20世纪30年代，微生物发酵生产初级代谢产品，如乳酸、乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸（WWI用于炸药干燥）及淀粉酶（蛋白质）等。16第十六页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术青霉素1928年Fleming发现青霉素，放线菌次级代谢产物；1939年Florey&Chain：提取纯化、临床试验；1941年，英美联合开发青霉素生产工艺，用于WWII伤员感染治疗1943年，生产1公斤20%含量青霉素表面培养法80,000个1L摇瓶劳动力消耗巨大（清洗、装料、灭菌、接种、培养、出料等操作）17第十七页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术

青霉素生产工艺的技术革命：深层发酵技术：5,000L，搅拌式发酵罐；放线菌菌种诱变、选育；发酵（培养）过程优化；提炼技术及其设备等方面；产品产量和质量都大幅度提高，生产效率明显提高，成本显著下降；促进发酵工程技术成为近代生物制药工业的基础技术。18第十八页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术深层发酵技术的广泛应用抗生素工业：链霉素、金霉素、红霉素等氨基酸发酵工业：上世纪五十年代酶制剂工业环境保护技术主要产品医药药品：抗生素、维生素、甾体激素、氨基酸等；食品工业：酶制剂、氨基酸、酵母、啤酒等；化学工业：醇类、有机酸、农药等。19第十九页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术生物分离（下游过程）技术与设备离子交换技术凝胶色谱技术膜分离技术亲和色谱技术1952年获诺贝尔化学奖（分溶层析法）20ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSynge第二十页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术疫苗工业1796年：牛痘疫苗1930年代：小鼠脑组织或鸡胚培养繁殖病毒方法黄热病、流脑、乙脑、森林脑炎和斑疹伤寒疫苗1950年代：离体细胞培养物中繁殖病毒的技术；小儿麻痹症、麻疹、腮腺炎等新疫苗。21第二十一页，共71页。22骨髓灰质炎疫苗

骨髓灰质炎病毒阳性mRNA病毒7,500核甘酸，编码唯一（壳）蛋白质直径30纳米结构最简单病毒骨髓灰质炎（小儿麻痹症）病毒从口腔进入，感染肠道黏膜上皮细胞并繁殖，经血液进入大脑或脊髓感染源为病患粪便和口鼻分泌物儿童较成年人更易感，导致终生残废第二十二页，共71页。2323骨髓灰质炎病毒体外繁殖1948年3月，Weller在设法用人胚胎肺细胞培养制备水痘病毒的实验中，将多余的几个试管接种了骨髓灰质炎病毒；前者失败，后者为体外制备病毒成功先例；54年诺贝尔生理医学奖EndersWellerRobbinsJonasSalk（1914

–1995）骨髓灰质炎灭活疫苗（Salkvaccine）1952年Verocellline（猴肾）培养接种骨髓灰质炎病毒福尔马林灭活1955年正式投入预防使用骨髓灰质炎疫苗

第二十三页，共71页。主要人类病毒疫苗24DiseaseSourceofvaccineViralconditionPoliomyelitisTC(humandiploidcellline,monkeykidneyLiveattenuated,inactivatedMeaslesTC(chickenembryo)LiveattenuatedMumpsTC(chickenembryo)LiveattenuatedRubellaTC(duckembryo,rabbitorhumandiploid)LiveattenuatedSmallpox(vaccinia)Lymphfromcalforsheep(glycerolated,lyophilized)LivevacciniaSmallpox(vaccinia)Chorioallantois,TC(lyophilized)VacciniaYellowfeverTCandeggs(17Dstrain)LiveattenuatedInfluenzaHighlypurifiedsubunitformsofchickenembryoallantoicfluid(formalinizedUVirradiated)InactivatedInfluenzaCC(MDCK,Vero)AttenuatedRabiesDuckembryo,rabbitorhumandiploidInactivatedAdenovirusCC(Humandiploidcells)LiveattenuatedJapaneseBencephalitisMousebrain(formalinized),CCInactivatedVenezuelanequinecephalomyelitisGuineapigheartcellcultureLiveattenuatedEasternequineChickenembryocellcultureInactivatedWesternequineChickenembryocellcultureInactivatedRussianspring-summerencephalitisMousebrain(formalinize)InactivatedTC-tissuecultureCC-cellcultureSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012第二十四页，共71页。生物技术发展简史：近代生物技术25生化制药：早期蛋白质药物生产，采用生化分离技术，从生物体构成中分离、纯化、制备用于疾病预防、治疗和诊断的生物活性物质原上海长城生化制药厂（1980）：抑肽酶：牛肺脏，胰蛋白酶抑制剂，胰腺炎细胞色素C：猪心脏，营养不良第二十五页，共71页。现代生物技术基因重组蛋白质表达技术1953年：DNA双螺旋结构；1966年：破译了DNA三联体密码，随之证明遗传的中心法则；1973年：建立了体外重组DNA方法；1982年：重组人胰岛素投放市场，由此开启重组蛋白质药物时代重组DNA技术日臻成熟；微生物发酵技术；大规模细胞培养技术；人类基因组计划。26第二十六页，共71页。从生化制药到生物技术制药

胰岛素（Insulin）

人血清白蛋白（HSA）27第二十七页，共71页。28胰岛素1921年由Banting

&

Macleod发现1955年Sanger测定牛胰岛素氨基酸序列A链（21AA），B链（30AA）二硫键连接：A链与B链之间两对，A链内部一对胰岛素的生理过程：胰岛素基因区位于第11对染色体短臂胰岛β细胞核DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆内质网，转译成前胰岛素原（105AA）经过蛋白水解酶剪切生成胰岛素原（86AA）；胰岛素原随细胞浆微泡进入高尔基体，由蛋白水解酶剪切生成胰岛素和C肽；在血糖刺激之下，β细胞分泌胰岛素，进入血液循环

第二十八页，共71页。29非人源胰岛素的临床应用第一代胰岛素（动物胰岛素）1922年动物胰岛素开始用于糖尿病临床治疗直至80年代初，医用胰岛素都是来自猪、牛胰脏提取不同种属哺乳动物胰岛素分子的氨基酸序列和结构稍有差异，其中猪胰岛素与人的最为接近（1-4个AA差异）主要问题容易发生免疫反应，包括过敏反应和抗异源胰岛素抗体形成（胰岛素作用失效，与胰岛素抵抗不是一码事）注射部位皮下脂肪萎缩或增生容易反复发生高血糖和低血糖第二十九页，共71页。30人胰岛素第二代胰岛素20世纪80年代，通过基因工程（重组DNA技术）将人胰岛素基因转染至细胞表达高纯度的合成人胰岛素；酵母：微生物发酵过程中国仓鼠卵巢（CHO）细胞：动物细胞培养免疫反应低，较少诱发免疫反应（包括过敏反应），注射剂量比动物胰岛素平均减少30%，皮下脂肪萎缩的现象也随之减少；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素；主要问题：在起效时间、峰值时间、作用持续时间上仍不能模拟生理性胰岛素分泌模式，使用也不方便第三十页，共71页。31人胰岛素类似物第三代胰岛素20世纪90年代末，基于对人胰岛素结构与功能的深入了解，研制更适合人体生理需要、更方便使用的胰岛素类似物利用基因工程技术改变胰岛素肽链上某些位点的氨基酸组合（蛋白质工程），改变等电点，增加六聚体强度；以钴离子替代锌离子；在分子中增加脂肪酸链，加大与白蛋白的结合；口服剂型（肠道生物利用率过低）第三十一页，共71页。32人血清白蛋白（HSA）理化性质：单链多肽（585AA）分子量66kD血浆唯一非糖基化蛋白质浓度范围35-50g/L含量约占血浆总蛋白的60%生理特性：在肝脏合成，半衰期约为20天；维持血液正常的渗透压；运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和非水溶性药物分子等第三十二页，共71页。33人血清白蛋白（HSA）在临床上，人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂；适应症：用于失血性休克、脑水肿、流产引起的白蛋白缺乏、肾病等；用量用法：静注或静滴：用量视病情而定；规格：注射液，每支（瓶）25%20ml。第三十三页，共71页。34天然人血清白蛋白的提取纯化工艺BritishJournalofAnaesthesia85(6):887-95(2000)现代纯化技术第三十四页，共71页。35人血清白蛋白（HSA）从人血清提取白蛋白的主要问题生物污染风险：传染病原体如HIC、HBV、HCV等高原料成本：人血浆原料昂贵，来源有限杂质：杂质种类多，含量高生产成本：纯化成本一般占生产成本的50%以上第三十五页，共71页。36人血清白蛋白（HSA）基因工程酵母大规模发酵：酵母属于微生物，易培养，繁殖快，遗传背景比较清楚，便于基因工程操作

构建HSA基因表达载体；转染酵母细胞；酵母细胞将HSA基因转录、翻译成多肽链；酵母细胞具有真核细胞的蛋白质翻译后加工能力，包括多肽链正确折叠（蛋白质活性）的胞内环境和糖基化修饰系统（对某些蛋白质活性至关重要），但HSA无需糖基化；酵母细胞具有蛋白质产物分泌机制，无需破碎细胞，产物浓度高，杂质含量低，利于降低纯化难度和成本；酵母大规模发酵属于成熟工业技术；生物污染风险极低。第三十六页，共71页。37生化制药的局限性原料来源有限，尤其是种属特异性高的药用蛋白（如hGH）即使是异种属蛋白质药物（如猪胰岛素），目标蛋白质在原料中的含量相对极低，而且杂质种类多、总含量高，不利于目标蛋白质的纯化，回收率低，因此生产效率低下，成本高，不利于商业化生产并满足市场需求（纯化成本一般占生产成本50%以上，牢记）原料来源：依原料性质而论安全风险：原料生物污染疯牛病/病毒污染/其它微生物污染猪很可能是人-禽类病毒传染的媒介避免动物来源原料是生物制药行业的总体趋势第三十七页，共71页。38生物技术制药的优越性开发安全、高效、低成本生产工艺，始终是促进生物制药行业发展的主要推动力原料：来源稳定，不受季节影响，成分明确，非动物工艺：过程重复性好，生产稳定，过程可放大以满足大规

模商业化生产产率：目标蛋白质浓度高，益于纯化，高收率杂质：宿主细胞蛋白药物安全性：免疫原性：非人源糖型有可能诱导免疫反应宿主内源性病毒明确（如啮齿类逆转录病毒颗粒），纯化工艺将其控制在安全范围之内宿主细胞蛋白质、DNA控制在安全范围从生产原料上阻断生物污染（如病毒）第三十八页，共71页。39

在蛋白质药物商业化生产中，借助于基因工程技术，细胞培养技术与微生物发酵技术大规模表达生产重组蛋白质药物，不但无限拓宽了蛋白质药物品种，也能在质量控制体系（GMP）的框架之内高效、低成本生产重组蛋白质药物，几乎全面取代生化制药（脏器药物提取）。第三十九页，共71页。基因工程（重组DNA技术）以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA片段，转基因），按预先设计的蓝图（基因表达载体），在体外构建成杂交DNA分子，然后导入活细胞，以细胞自有机制对转基因进行转录、翻译，甚至后修饰、分泌。宿主细胞选择原核：E.coli真核：哺乳动物、昆虫、酵母40第四十页，共71页。4141遗传信息传递第四十一页，共71页。42蛋白质结构一级结构：按照基因上遗传密码的排序，不同氨基酸通过肽键连接成线性序列；二级结构：依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构，主要为α-螺旋和β-折叠等；三级结构：通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构（蛋白质分子或亚基）。四级结构：用于描述由不同多肽链（亚基）间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。第四十二页，共71页。43蛋白质翻译后修饰在翻译完成之后，前体蛋白通常没有活性，需要一系列的翻译后加工步骤，才能具有生物学功能；翻译后加工类型：N-端Met的切除二硫键的形成肽链剪切化学修饰：引入官能团，以改变蛋白质的化学性质磷酸化、硫酸化、醋酸化、烷基化、乙酰化、生物素化、硫辛酸化等糖基化：糖蛋白质普遍存在第四十三页，共71页。44蛋白质糖基化蛋白质与寡糖结合方式：数十个基因参与O-糖苷键：丝氨酸、苏氨酸的羟基与糖的半缩醛羟基N-糖苷键：天冬酰胺的酰胺基与糖的半缩醛羟基同一糖基化位点糖基结构可能不同（microheterogeinity）并非所有糖基化位点全部占用，同蛋白分子可能有不同糖基化组合（macroheterogeinity）第四十四页，共71页。45蛋白质糖基化糖基化对蛋白质的影响：细胞内：糖基化在肽链（ER）翻译与折叠的同时即已开始，以影响多肽的溶解性、聚集和折叠产物的稳定性糖基化对蛋白质分子在血液循环中的半衰期影响甚大非糖基化蛋白质比糖基化蛋白质更快被肝脏截获，糖链末端唾液酸化可以降低肝脏对蛋白质的截获糖基化为许多蛋白质生物活性所必需IgG：与补体和Fc受体结合（ADCC）所必需Epo：生物活性所必需第四十五页，共71页。46蛋白质糖基化糖基的免疫原性（Antigenicity）绝大多数蛋白质药物系糖蛋白质；细胞内糖基化酶系高度保守，糖型具有种属特异性；非人细胞所表达蛋白质有可能因糖型差异而引发免疫反应，诱导体内产生抗体，其后果是蛋白质药物被抗体中和而失效；重组蛋白质药物生产必须采用适当细胞株，避免或最大限度降低由糖基引起的免疫原性第四十六页，共71页。47重组蛋白质药物表达主要细胞（株）来源细胞（株）注释中国仓鼠ChineseHamsterOvary（CHO）由于历史原因，CHO细胞是目前采用最多的生产细胞株。非人源糖型，免疫原性未引起大问题人HEK293,PerC6人源糖型，潜力巨大小鼠NS0,SP2/0,hybridomas非人源糖型，免疫原性很低叙利亚仓鼠BHK昆虫Sf9,Hi-Five非人源糖型，疫苗（抗原）表达酵母毕赤酵母非人源糖型，非糖基化蛋白质或疫苗（抗原）表达细菌大肠杆菌形成包涵体，非糖基化、无二硫键蛋白质表达，二硫键可在氧化复性环境或伴侣蛋白协助下形成第四十七页，共71页。4848MolecularCellBiology(5thed.)byLodishetal.原核细胞-真核细胞第四十八页，共71页。4949蛋白质产物分子量真核：基本上对分子量没限制原核：适合表达分子量低于5KD的蛋白质多肽翻译后修饰机制真核：YES，但种属差异很大原核：NO后修饰为许多蛋白质功能所必需如抗体、促血红素产物分泌机制真核：YES，蛋白质以天然构象形式分泌至胞外原核：NO，缺乏多肽链正确折叠与二硫键正确连接的机制，多肽以包涵体形式存在，后续加工包括细胞破碎、包涵体溶解、蛋白质复性，工艺复杂，成本高真核与原核细胞基因表达的主要差别第四十九页，共71页。生物技术药物的特性分子结构复杂：分子量较大；分子结构复杂，除肽链之外，可能还有二硫键连接以及翻译后修饰如糖基化、磷酸化等具有种属特异性：治疗针对性强、疗效高：生物药物是天然存在的蛋白质或多肽，量微且生物活性强，极小用量就会产生显著效应，相对来说不良反应较少，毒性较低，安全性较好；稳定性低：易变性失活，易被蛋白酶破坏，易微生物污染；50第五十页，共71页。生物技术药物的特性

5.基因稳定性：生产菌株或细胞系的稳定性和生产条件的稳定性非常重要，变异会导致药物生物活性的变化或不希望的生物学活性。6.免疫原性：一些人源性蛋白质在人体中也能产生抗体，重组药物可能与天然蛋白质存在结构和构象上的差异；7.体内半衰期短：生物药物降解迅速，体内降解的部位广泛；8.受体效应：许多生物药物是通过与特异性受体结合、信号传导机制而发挥药效作用，且受体分布具有动物种属特异性和组织特异性，因此在体内有组织特异性和药效反应快的特点；51第五十一页，共71页。生物技术药物的特性

9.多效性和网络性效应：许多生物药物作用于多种组织或细胞，且在体内相互诱生、调节、协同或颉颃，形成网络效应，从而具有多种功能、多种药理作用；10.检验的特殊性：生产系统复杂，生产批次间的一致性及安全性的变化大于化学产品，因此，对生产过程的监测、GMP步骤的要求和质控的要求更为重要和严格。52第五十二页，共71页。非动物宿主细胞生产蛋白质药物53Drug(Tradename)Activity/UseGranulocytecolony-stimulatingfactor(Neupogen)WhitebloodcellgrowthforneutropeniaInsulin(Humulin)Diabetes-Interferon(Intron-A)Anticancer,viralinfectionsSomatotropin(Humatrope)GrowthdeficienciesSomatotropin(Protopin/Nutropin)GrowthdeficienciesInterleukin-2(Proleukin)KidneycancerSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012第五十三页，共71页。动物细胞表达非抗体蛋白质药物54Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameTypeTherapeuticuseManufacturerUSapprovalHostActivaseTissueplasminogenactivatorAcutemyocardialinfarctionGenentech1987CHOEpogen/ProcritEPOAnemiaAmgen/OrthoBiotech1989CHOPulmozymeDeoxyribonucleaseICysticfibrosisGenentech1993CHOCerezyme-glucocerebrosidaseGaucher’sdiseaseGenzyme1994CHOAvonexInterferon-RelapsingmultiplesclerosisBiogenIdec1996CHOFollistim/Gonal-FFolliclestimulatinghormoneInfertilitySerono/NVOrganon1997CHOEnbrelTNFreceptorfusionRheumatoidarthritisAmgen,Wyeth1998CHOBenefixFactorIXHemophiliaAWyeth2000CHOTenecteplaseTissueplasminogenactivator

(engineered)AcutemyocardialinfarctionGenentech2000CHOReFactoFactorVIIIHemophiliaAWythe2000CHOAranespEPO(engineered)AnemiaAmgen2001CHORebifInterferon-RelapsingmultiplesclerosisSerono2002CHOFabrazyme-galactosidaseFabrydiseaseGenzyme2003CHOAdvateFactorVIII(engineered)HemophiliaABaxter2003CHOLuverisLuteinizinghormoneInfertilitySerono2004CHONaglazymeN-acetylgalactosamine4-sulfataseMucopolysaaccharidosisVIBioMarin2005CHOOrenciaIg-CTLA44fusionRheumatoidarthritisBristol-MyersSquibb2005CHOMyozyme-galactosidasePompe’sdiseaseGenzyme2006CHOAldurazymeLaronidaseMucopolysaaccharidosisIGenzyme2006CHO第五十四页，共71页。动物细胞表达抗体药物（早期）55Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameMabTypeTherapeuticuseManufacturerUSHostOKT3Anti-CD3,MurineAcutekidneytransplantrejectionJ&J1986HybridomaReoProAnti-AbciximabPreventionofbloodclotsCentocor1994SP2/0RituxanAnti-CD20Non-Hodgkin’slymphomaGenentech1997CHOZenapaxHumanized,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionPDL1997NS0SimulectChimeric,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionNovartis1998SynagisHumanized,anti-A-antigenofRSVLowerrespiratorytractdiseaseMedImmune1998CHORemicadeAnti-TNF-ActiveCrohn’sdiseaseCentocor1998SP2/0HerceptinAnti-HER2MetastaticbreastcancerGenentech1998CHOMylotargAnti-CD33AcutemyeloidleukemiaWythe2000CHOCampathAnti-CD52ChroniclymphocyticleukemiaMillennium2001CHOZevalinAnti-CD20,murineNon-Hodgkin’slymphomaBiogenIdec2002CHOHumiraAnti-TNF-RheumatoidarthritisAbbott2002CHOXolairHumanized,anti-IgEModerate/severeasthemaGenzyme2003CHOBEXXARAnti-CD20FollicularNon-Hodgkin’slymphomaGSK2003CHORaptivaAnti-CD11aChronicpsoriasisGenentech2003CHOErbituxChimericmAbanti-hEGFreceptorEGFRexpressingmetastaticcolorectalcancerBMS,Merck2004CHOAvastinAnti-VEGFMetastaticcolorectal&lungcancerGenentech2004CHOVectibixAnti-EGFRMetastaticcolorectalcancerAmgen2006CHOSolirisAnti-CD5ParoxysmalnocturnalhemoglobinuriaAlexion2007NS0第五十五页，共71页。抗体药物杂交瘤细胞与单克隆抗体Kohler&

Milstein（1975）将小鼠骨髓瘤细胞（有分裂增殖能力）与免疫的动物脾细胞（B细胞，分泌单一种抗体）融合，形成即能增殖又能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞；抗原-抗体结合具有极高特异性与亲和力，抗体可以成为靶向药物的基础（生物导弹）。56第五十六页，共71页。抗体药物作用机制57中和效应因子：抗体与肿瘤坏死因子（TNF-）结合，使其不能再与细胞表面受体结合，减缓炎症，适用于类风湿性关节炎、牛皮癣和克罗恩病；肿瘤生物治疗：抗体可以负载细胞毒性药物或放射性，在肿瘤组织上与表面抗原结合、富集、杀伤肿瘤细胞；抗体锚定肿瘤组织之后，其Fc与天然免疫细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）表面Fc受体结合，诱发后者杀伤效应；封闭T淋巴细胞表面PD-1或肿瘤组织表面PD-L1，阻止肿瘤细胞对T淋巴细胞的压制，达到T淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应。第五十七页，共71页。南开大学药学院细胞培养工程细胞培养工程Nature480(22):480-489,29December2011CancerimmunotherapycomesofageMellman,Coukos&Dranoff第五十八页，共71页。59激活或抑制T淋巴细胞功能的抗体药物对于肿瘤治疗具有很好的前景已处于临床试验阶段抗体药物第五十九页，共71页。6060抗体药物类型抗体药物类型演化降低种属差异免疫反应提高药效OKT3鼠源抗体免疫反应使其作用失效抗体工程：IgG抗体结构与功能第六十页，共71页。干细胞与组织工程

特殊生物反应器专用无血清培养基第六十一页，共71页。肿瘤免疫治疗（DC-CIK）62第六十二页，共71页。6363现代动物细胞培养

生物医药工业的主要技术构成分子生物学与基因工程技术基因表达机制基因表达载体构建宿主细胞设计：CHO：DHFR双敲除CHO/NS0：GS系统PERC6，HEK293蛋白质纯化亲和层析：Protein-A/G;AKTA：提高纯化工艺过程开发速度和质量；更多的树脂选择；膜技术：过滤、浓缩。大规模细胞培养技术细胞株构建与筛选合成培养基无血清培养基无蛋白培养基无动物成份培养基化学成份明确培养基搅拌式生物反应器