干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的变化研究

干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的变化研究第1页/共40页目录1、研究背景及意义2、研究内容及研究目标3、研究方案及可行性分析4、本研究的特色与创新之处5、研究计划及预期研究结果6、研究基础第2页/共40页水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口。水稻也是我国的第一大农作物，在粮食生产和国民经济中起着极其重要的作用。

1、研究背景及意义第3页/共40页影响水稻产量的因素产量增加培育高产新品适宜生长条件加强管理病虫害恶劣环境疏于管理产量降低水稻第4页/共40页水分亏缺造成的植物生长减缓和作物减产的损失超过了其他逆境因素减产的总和。

第5页/共40页干旱胁迫对水稻生理生化的影响

当干旱等逆境来临时，植物可以主动感知环境刺激信号并激发各种抗旱反应。干旱影响光合作用主要是通过气孔限制和非气孔限制两个因素造成的。第6页/共40页叶片生长受抑制光合有效面积降低气孔导度下降类囊体膜上光能的吸收、传递ATP合成的抑制。羧化效率降低干旱干旱对水稻光合作用的影响第7页/共40页类囊体－光合作用的光反应场所

四种复合体（光合系统I－PSI，光合系统II－PSII，ATP合成酶系，细胞色素b6/f复合体）至少含有70种蛋白质用以完成光合反应。蛋白质在质体基因组与核基因组的协同表达，蛋白质积累和合成许多辅助蛋白的协同作用机制都是需要解决的问题。第8页/共40页本实验选用基因组测序完成的日本晴作为材料，将干旱胁迫对水稻叶片的光合特性的影响和对水稻类囊体膜蛋白质组的影响相结合进行研究，以期从微观的蛋白质组水平上阐明宏观上干旱影响水稻光合生理的机制。为培育抗干旱的高产水稻新品种提供理论依据和实验依据。研究意义第9页/共40页1、干旱胁迫对水稻生理活性的影响2、干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的影响

3、干旱胁迫对水稻光合生理变化的调控机理

2.1研究内容2、研究内容及目标第10页/共40页

2.1.1干旱胁迫对水稻生理活性的影响干旱不但明显降低了植株的净光合速率，使叶绿体超微结构损坏，叶绿素含量降低，而且降低了Rubisco酶和碳酸酐酶等酶的活性。干旱也影响了其他与光合作用有关的生理生化过程，如降低气孔导度，使光合产物运输受阻等。当干旱达到一定程度，植物的光合机构就会遭到破坏，使光合能力出现大幅的下降。第11页/共40页收集处理和对照叶片处理移栽育秧选种日本晴测光合速率，荧光等生理指标移栽于水培池中干旱处理第12页/共40页

类囊体膜有四种复合体（光合系统I－PSI，光合系统II－PSII，ATP合成酶系，细胞色素b6/f复合体），它们各自又都有着辅助蛋白。这四种复合体至少含有70种蛋白质用以完成光合反应。干旱会引起类囊体膜上光能的吸收、传递和ATP合成的抑制。2.1.2干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的影响

第13页/共40页2.1.3干旱胁迫对水稻光合生理变化的调控机理

干旱是导致水稻光合潜能不能充分发挥、进而导致产量降低的最重要的环境因素。从蛋白质组水平可以更好地阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制，如对光合作用光能利用效率和碳同化作用调节机理的认识等。第14页/共40页2.2研究目标（1）干旱处理条件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本实验室的叶绿体（及其亚组分）膜蛋白的提取和鉴定方法（3）建立干旱处理的类囊体膜蛋白质组的变化图谱（4）初步阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制第15页/共40页2.3拟解决的关键问题（1）如何简单有效分离高纯度的类囊体膜蛋白

（比如寻找适合水稻类囊体膜蛋白质组研究的裂解液配方等）（2）水稻类囊体膜蛋白质组图谱的建立（3）推断水稻光合作用受干旱胁迫的响应机理以及植物对干旱环境的适应机制第16页/共40页3.主要的实验方法3.1生理指标的测定方法（1）土壤含水量的测定土壤含水量（％）＝（土壤湿重－土壤干重）/土壤湿重×100（2）叶片水势的测定叶片水势用压力室法（Soilmoisture）测定。（3）叶片光合速率、气孔导度和叶绿素荧光参数的测定用LI-6400P光合仪测水稻倒二叶的光合速率和气孔导度。用叶绿素荧光仪测水稻倒二叶叶绿素荧光参数。第17页/共40页完整叶绿体沉淀破碎叶绿体1.2mol/L蔗糖梯度液1.5mol/L蔗糖梯度液图2蔗糖密度梯度离心后各梯度的组分示意第18页/共40页加入10倍体积的含0.07％β－巯基乙醇的丙酮类囊体膜-20℃沉淀45min4℃，35000×g离心15min10倍体积的含10％TCA的丙酮溶液加入4℃，35000×g离心15min沉淀物适量LysisSolutionI加入37℃，水浴1hr同时充分搅拌且超声波震荡3次20℃，19000×g离心15min取上清液沉淀物10倍体积的含0.07％β－巯基乙醇的丙酮-20℃沉淀1hr加入4℃，35000×g离心15min重复2—3次真空冻干图2蛋白质提取流程图3.2类囊体膜蛋白质的提取第19页/共40页3.3Westernblotting法鉴定类囊体膜

第20页/共40页类囊体膜蛋白质组的Westernblotting结果A、B分别是用抗PSI抗体、抗LHCII抗体检测的结果；泳道1、2的上样量分别为50μg、100μg；AB1212118kDa90kDa49kDa35kDa26kDa19kDaPSILHCII图3水平半干式电泳印迹示意水平半干式电泳印迹示意第21页/共40页蛋白质组学研究方法样品全息制备双向凝胶电泳图像分析质谱和蛋白质鉴定第22页/共40页TheCompleteProteomicsSolutionSamplePrepImageacquisitionImageanalysisSamplelabelling2DSeparationAutomatedspotpickingAutomatedspotdigestionAutomatedMALDIspottingMSLaboratoryworkflowsystem第23页/共40页样品制备固相pH梯度胶条的水化第一向等电聚焦第二向SDS检测染色3.4双向电泳第24页/共40页硝酸银染色电泳后的凝胶固定液固定，脱色摇床振荡1h敏化液增敏30min银染液摇床振荡20min显色液显色，大约3min终止液停显10min水洗5min,重复3次水洗5min,重复3次染色后的凝胶第25页/共40页3.5图像分析凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：第26页/共40页3.6数据库比对差异蛋白质MascotWizard软件（MatrixScienceLtd.），设置适当的参数和数据库，对目的蛋白质的PMF进行网上数据库匹配。根据实际等电点和分子量以及匹配的结果确定与目的蛋白质的PMF最相符的蛋白质。第27页/共40页3.7可行性分析（1）本实验所提出的技术路线和实验方案是切实可行的；（2）本研究所涉及的一些关键技术和研究方法

都是本实验室的常规方法；

（3）本实验是由工作多年的青年教师完成，长期从事蛋白质化学和蛋白质组学方面的研究工作，积累了比较丰富的经验。第28页/共40页4、本研究的特色与创新建立水稻蛋白质组学研究的技术平台建立了一套分离纯化水稻叶绿体和类囊体膜蛋白并对其鉴定的系统方法。建立研究水稻（日本晴）响应干旱后类囊体膜蛋白质组的变化以及阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制的系统方案第29页/共40页第一阶段：栽培获取材料和生理数据的测定。第二阶段：类囊体膜的分离、提取蛋白第三阶段：双向电泳和图像分析第四阶段：差异点进行质谱鉴定，网上搜库比对第五阶段：整理数据，完成论文5.1研究计划5、研究计划及预期结果第30页/共40页5.2预期研究结果（1）测定干旱处理条件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本实验室的叶绿体（及其亚组分）膜蛋白质组学的研究方法（3）建立干旱处理的水稻类囊体膜蛋白质组的双向电泳图谱，初步阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制第31页/共40页6.1工作基础土壤干旱处理水稻样品培育技术土壤含水量的测定技术水稻蛋白质的提取和定量技术蛋白质免疫印迹技术双向电泳技术银染和考染技术图象分析技术水稻蛋白质的原位酶解技术质谱分析技术

6、研究基础第32页/共40页6.2前期研究工作的积累

随着干旱进行，土壤含水量迅速下降，但两品种的土壤含水量下降的速度和程度存在比较大的差异。9311的土壤含水量的下降速度和程度大于日本晴的土壤含水量。图3停止灌水后土壤含水量的变化（1）土壤干旱对土壤含水量(SWC)的影响第33页/共40页（2）土壤干旱对水稻叶片水势的影响

随着停止灌溉时间的延长，9311和日本晴叶片水势均呈现明显下降趋势，品种间差异与土壤含水量的变化相似。图4土壤干旱对水稻叶片水势的影响第34页/共40页（3）土壤干旱和强光处理对叶片光合速率的影响图5土壤干旱和强光对水稻叶片光合速率的影响上图为日本晴，下图为9311。箭头表示重新灌水时间叶片的光合速率随着土壤干旱程度的不断加剧而下降，两水稻品种表现出类似的变化趋势。复水后叶片的光合速率又恢复到干旱前的水平。强光对两品种叶片光合速率有显著的抑制作用（即光抑制），且抑制的程度随干旱程度的加剧而加重。第35页/共40页（4）干旱和强光对叶片叶绿素荧光特性的影响随着干旱程度的加深，日本晴的Fv/Fm迅速下降，复水以后重新回升。光抑制的情况下，Fv/Fm下降更为显著。Fv’/Fm’呈现相似的变化趋势，但是强光处理对Fv’/Fm’的变化影响不大图6土壤干旱和强光对水稻日本晴叶片PSII光化学量子产量的影响第36页/共40页（5）水稻叶片叶绿体提取和完整率的鉴定

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法所获得的叶绿体经过荧光显微镜和光学显微镜检测，完整率和纯度高。

AB图7分离获得的水稻叶片叶绿体荧光照片（A）和光学显微镜照片